高效液相色谱法测定伊维菌素脂质体药物的含量及包封率_佘永新

高效液相色谱法测定伊维菌素脂质体药物

的含量及包封率

佘永新1,巴桑旺堆1,色珠1,何书海3,王静2,董禄德1,拉巴次旦1,杨德全1

(1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所,拉萨　850009;2.中国农业科学院农业质量标准与检测

技术研究所,北京　100081;3.河南省信阳市农业专科学校,信阳　464000)

摘要:本试验旨在建立伊维菌素脂质体载体药物含量及包封率测定的高效液相色谱法。Wa te rs surfire C18柱(150mm×2.1mm,5μm),流动相为乙腈—甲醇—水(62∶30∶8),流速1mL/min,检测波长245nm,进样量10μL,柱温30℃。采用凝胶过滤法、透析法、冷冻超速离心法、超滤离心法4种方法对脂质体与药物进行分离。结果表明,在优化色谱条件下伊维菌素与辅料及溶剂峰均得到良好分离,伊维菌素在1～50μg/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.9998,n=5),最终采用超速冷冻离心法可将脂质体与药物很好的分离,伊维菌素脂质载体的包封率可达98.54%±1.6%。该方法准确可靠、简单快速,可用于伊维菌素脂质体载体药物含量及包封率的测定。

关键词:伊维菌素;脂质体;包封率;高效液相色谱法;超速冷冻离心法

中图分类号:S859.83 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2010)04-0080-05

伊维菌素(Ive rmectin,IVM)是一种新型的由阿维链霉菌发酵产生的半合成大内酯抗生素类驱虫药,其对多种寄生虫均具有驱杀作用,已经证实IVM的抗虫谱包括3纲(线虫纲、昆虫纲、蜘蛛纲)、

收稿日期:2009-11-13

作者简介:佘永新(1972-),男,甘肃人,博士,副研究员,研究方向:食品安全快速检测技术。

基金项目:西藏自治区科技厅重点项目(NO10-1)。12目、73属的寄生虫,特别是对线虫和节肢动物有良好的驱杀作用,是目前人们公认的具有广谱、高效、安全、残留少、无抗药性的抗生素(Aránzazu等, 2009;mura,2008;Mckellar等,1996;H ans等, 2007)。目前传统的制剂(如片剂、注射液、乳剂、喷剂、浇泼剂、粉剂等)均表现有效期短、需要重复给药等缺点,不仅增加了劳动力成本和对动物的应激,同时也容易产生耐药性,甚至导致中毒。使用剂量不

10Zsak L,Borca M V.Preclinical diagnosis of African swine fever

in contact-ex posed swine by a real-time PC R as say[J].J ou rnal of

Clinical M icrobiology,2005,43(1):112～119.

Research and Assessment of Real-time Quantitative PCR Assay

for the Detection of African Swine Fever Virus

GUO Shao-ping1,2,LIU Jian2,WU Shao-qiang2

(1.Inner M ongo lia Ag ricultural U niver sity,Ho hho t010018,China;

2.Chinese Academy of I nspection and Q ua rantine,Beijing100029,China)

Abstract:A real-time qua ntitative PC R(qP CR)assay for the de tectio n o f A frican swine fever v ir us(ASF V)has bee n dev el-o ped by designing the primers and TaqM an pro be acco rding to the sequence o f the gene K205R.T he reaction so lutio ns and con-ditions w ere o ptimized by using different concentratio ns of the prime rs and M g2+and different annealing temperature.T he mask samples wer e adopted to ve rify its ac tual detective efficiency by adding the plasmid D NA into swine live r tissue.T he qPCR detective method of A SFV based on p72reco mmended by OI E w as selected and mo dified to be as contro l me tho d.Re-sults show ed that the amplification efficiency o f the deve loped qP CR based on detectio n of K205R was be tte r than tha t based on p72and w as sensitive and specific eno ug h to de tect A frican sw ine fever virus infection.

Key words:Af rican sw ine fever v ir us;real-time quantitativ e PCR;K205R;detection;resea rch;asse ssment

当等诸多因素可导致其在动物组织中产生的蓄积性残留,对人和生态环境带来负面影响。

脂质体是一种新型的载药系统,由于脂质体具有靶向性和淋巴定向性、缓释作用、降低药物毒性、提高稳定性等特性(陆彬,1998;郑宁等,2004),已经成为目前各种药物缓释和控释制剂等研究领域的热点。目前国内外已经研制出了许多药物的脂质体剂型并应用到了临床实践中(席枝侠等,2005)。由于伊维菌素具有良好的脂溶性和较大的相对分子质量,适于制成脂质体,目前对于伊维菌素脂质体的研究尚处于探索阶段(徐霞等,2005)。关于各种制剂中伊维菌素的含量测定方法较多,刘根新等(2008)用高效液相色谱法测定了乳剂中伊维菌素的含量;梁先明(2000)用薄层扫描色谱法测定了伊维菌素口服液的含量;蒋晨阳等(2005)用液相色谱法测定了伊维菌素泼浇剂中伊维菌素的含量;其他学者用紫外分光光度法测定了伊维菌素脂质体含量(徐霞等, 2005)。到目前为止,伊维菌素脂质体中伊维菌素含量的测定均为紫外分光光度计法。为了更好地控制脂质体的质量,本试验采用反相高效液相色谱法(RP-H PLC)测定伊维菌素脂质体的含量及包封率。1　材料与方法

1.1　仪器设备　美国Waters2695高效液相色谱仪,带二极管阵列检测器,色谱柱(150mm×

2.1 mm,5μm);M E-110V旋转蒸发仪(含冷却水循环装置,日本);JA-10T型透射电子显微镜(日本H i-tachi公司);M alvern-2000型激光散射粒径分析仪(英国M alvern公司);IEC CL31R台式高速冷冻离心机,美国赛默飞世尔(Therm o Fisher)公司;恒温水浴锅、磁力搅拌器、超声波、H Y-5回旋震荡器均为国产。

1.2　药品与试剂　伊维菌素原粉购自北京某公司,本规格22,23-二氢伊维菌素BIa不少于93.0%, BIa+BIb不少于98.0%;伊维菌素标准品,Sigma 公司提供;伊维菌素脂质体,实验室自行制备,包封率为98.54%,制成浓度为10mg/m L的乳白色混悬液。超滤离心管(10ku,美国Millipore公司),葡聚糖凝胶G-50(美国Pharmacia公司),甲醇、乙腈、曲拉通X-100均为国外产品,由北京某公司提供。其他试剂均为分析纯。

2　结果

2.1　色谱条件　色谱柱选择Waters surfire C18柱(150mm×2.1mm,5μm),流动相为乙腈—甲醇—水(62∶30∶8),流速1.0m L/m in,检测波长245 nm,柱温30℃,进样量10μL。

2.2　标准曲线　精确称取伊维菌素对照品20mg,置100m L容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得200μg/m L储备溶液。精确量取储备液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5mL,置于7个10 m L的容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为1、2、5、10、20、30、50μg/m L的系列溶液,分别进样10μL,以浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标作图,通过色谱工作站,绘制标准曲线,得回归方程: Y=2920.6X+17.8072,R2=0.9927。结果表明,伊维菌素浓度在1～50μg/m L范围内具有良好的线性关系。

2.3　专属性试验

2.3.1　对照品溶液的制备　精确量取伊维菌素对照品储备液1m L置10mL量瓶中,用流动相定容至刻度,得浓度为20μg/m L的伊维菌素对照品溶液。

2.3.2　供试品溶液的制备　精确量取伊维菌素脂质载体乳液1.0m L,加入5%T ritonX-100乙醇溶液2m L破乳,超声10min,后用流动相定容至10 m L,15000r/min离心10min,取上清液经0.22μm 滤膜过滤后取滤液10μL进样测定,得伊维菌素脂质体总药量。

2.3.3　空白纳米脂质载体溶液的制备　精确量取空白伊维菌素脂质载体溶液1.0m L,按“2.3.2”中介绍的方法操作,即得空白脂质载体破乳液。取伊维菌素对照品溶液、空白脂质体破乳液和伊维菌素脂质体破乳液各10μL进样,色谱图见图1、2、3。由色谱峰可见辅料峰与伊维菌素峰分离良好,辅料对伊维菌素测定无干扰,方法专属性强,伊维菌素色谱峰的保留时间约为10.04min。

2.4　精密度试验　精确配制低、中、高3种浓度(1、10、50μg/m L)的伊维菌素对照品溶液各5份,在“2.1”条件下分别进样10μL,分别于1d内测定5次,连续测定5d,计算日内和日间精密度。由测定结果可知,3种浓度对照品溶液的日内RSD分别为

1.0%、

2.1%、0.9%(n=5),日间RSD分别为

2.5%、1.4%、

3.6%(n=5),结果表明该方法精密度良好。

2.5　回收率试验　精确称取浓度为200μg/m L伊维菌素溶液1.5m L于10mL容量瓶,再加入空白