真核基因表达系统资料
真核生物的基因表达调控
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• 锌指结构域The zinc finger domain
锌指结构有2种形式： C2H2 zinc finger和C4 zinc finger •C2H2 zinc finger：由12个氨基酸组成的环，通过2个半胱氨 酸（C，Cys）和2个组氨酸（H，His）残基固定，这4个残基 与Zn2+在空间上形成一个四面体结构。 一般情况下需要3个 或更多的C2H2型锌指才能与DNA结合，如在TFIIA有9个重复， 转录因子SP1有3个重复。 •C4 zinc finger： Zn2+与4个半胱氨酸（C，Cys）结合，存 在于类固醇激素受体转录因子中。
限定于结构域之内。
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反式作用因子的结构与功能
（1）概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开 放（正调控）或关闭（负调控）。
（2）通用或基本转录因子—RNA聚合酶结合启动子所必需 的一组蛋白因子。如：TFⅡA、 TFⅡB、 TFⅡD、 TFⅡE 等。 （3）特异转录因子( special transcription factors)—个别 基因转录所必需的转录因子.如：OCT-2：在淋巴细胞中特 异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。
(2) 动态模型（dynamic model）：认为转录因子与组 蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经 历结构上的改变，即染色质重塑。在染色质重塑过 程中，某些转录因子可以在结合DNA的同时使核小 体解体。
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组蛋白的乙酰化-去乙酰化 蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种 重要的形式，通过乙酰化或去乙酰化，改变了染色质 结构或是转录因子的活性，可以调节基因转录的活性。 组蛋白的乙酰化和去乙酰化能打开或关闭某些基因， 增强或抑制某些基因的表达。 组蛋白的8个亚基上有32个潜在的乙酰化位点。组 蛋白的乙酰化过程由组蛋白乙酰转移酶催化完成。
真核生物基因表达调控
酸性激活域 (D/E-rich) 谷氨酰胺(Q)富含域 脯氨酸(P)富含域
蛋白质-蛋白质结合域 （dimerization, co-factors）
1） TF最常见的DNA binding domain
Zinc Finger
bZIP
Homeodomain
bHLH
(1) 锌指(zinc finger)
2. The pri5’ capping 3’ formation / polyA splicing
3. Mature transcripts are transported to the cytoplasm for translation
Chromatin
epigenetic control
Protein degradation RNA silencing
一般而言的基因表达调控范畴
二、基因表达的时间性及空间性
（一）时间特异性
按功能需要，某一特定基因的表达严格按 特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间 特异性(temporal specificity)。
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His C-terminal: α-helix binding DNA
常结合GC box
(2) 碱性亮氨酸拉链 bZIP
(3) 碱性螺旋-环-螺旋bHLH
bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)
2） TF常见的trans-activation domain
– usually expressed at high level – the level of their gene expression may vary
分子生物学真核生物表达系统ppt课件
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
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外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
12.02.2020
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三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
12.02.2020
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（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
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b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
原核生物真核生物基因表达比较
08
40s小亚基首先与Met-tRNA(Met上角标）相结合
09
再与模板mRNA结合
10
最后与60s大亚基结合生成起始复合物
肽链合成起始:
原核生物肽链合成的延长：
进位: 氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核蛋白体A位 2. 成肽:转肽酶催化，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA转移到A位，与A位上氨基酰-tRNA的α-氨基结合形成肽键 3. 转位转位酶催化，核蛋白体向3´-端移动一个密码子的距离，使mRNA上下一个密码子进入核蛋白体A位、而占据A位的肽酰-tRNA移入P位 延长因子: EF-Tu EF-Ts EF-G
真核生物：转录起始需要启动子 、RNA聚合酶和转录因子的参与。 少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物。
转录延长：
转录终止：
依赖ρ因子的转录终止 非依赖ρ因子的转录终止 Ρ因子
真核生物的转录终止：在超出千百个核苷酸后停顿， 转录后修饰有多聚腺苷酸（poly A）尾巴结构加进去 。在读码框架下游常有一组公共序列AATAAA 及 GTGTGT序列，这些序列称为转录终止修饰点。
真核延长过程与原核基本相似 但有不同的反应体系和延长因子：eEF-1α eEF-1βγ eEF-2 真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落
核蛋白体A位出现mRNA的终止密码子后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离。
原核生物终止阶段需要释放因子RF-1、 RF-2和 RF-3参与
核蛋白体包括 rRNA(核糖体RNA) 和蛋白质，直径为 20-25nm,真核细胞的核蛋白体比原核细胞的大。
真核生物表达系统汇总
2020年8月10日星期一
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
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（3）选择标记
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b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
真核生物基因表达
真核生物的基因表达调控染色质基因激活转录和转录后加工翻译和翻译后加工一、染色质水平基因表达调控（一）染色质结构与功能：常染色质（euchromatin）：，对DNase I敏感，DNA可降解为约200 bp 或其倍数的片断；基因表达处于活性状态。
异染色质（heterochromatin）：结构高度致密处于凝聚状态的染色质，对DNase I不敏感。
基因表达活性处于阻遏状态。
组成性异染色质：所有细胞，整个细胞周期都存在的异染色质。
其DNA不含基因，因而一直保持凝聚状态。
兼性异染色质（facultative heterochromatin）：在特定细胞，生长发育的特定阶段，由常染色质凝聚转变成的异染色质。
（二）染色质重塑：染色质重塑（chromatin remodeling）：与转录相关的染色质局部结构的改变称之。
主要有：核小体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
1、核小体重塑：（nucleosome remodeling）核小体重塑：ATP依赖性酶蛋白复合体参与的核小体的移位、替换和去组装改变。
核小体重塑过程：基因活化蛋白结合；ATP依赖性酶蛋白复合体结合转录活性区；ATP依赖性酶水解A TP，提供能量；移去或替换核小体。
2、DNA的甲基化：常见真核生物DNA5’-CpG-3’序列，即CpG岛(CpG-rich islands)胞嘧啶第5位C被甲基化。
甲基化程度使DNA结构稳定。
甲基化程度与基因表达活性呈反比关系。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
组蛋白的乙酰化与去乙酰化酶：组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyl transferases HATs ) 组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase HDAC）修饰位点：核心组蛋白外周结构域，氨基末端Lys残基的NH3。
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
讲第八章真核基因的表达调控(讲稿)
（3）轴上有一些染色粒，代 表染色质紧密螺旋化的部位。 同时两条染色单体向两边伸出 许多侧环，侧环是RNA活跃转 录的区域。
29
2、基因扩增
定义：是某基因的拷贝数专一性大量增加的现 象，可短时间内产生大量基因产物满足生长需 要。基因活性调控的一种方式。
同的剪接方式形成不同mRNA。
23
PS
DNA
初始转录本： 在唾腺中转录
外显子 S
PL 外显子 L
外显子 2 外显子 3
50b 2800bp
161bp 4500bp 205bp 327bp
初始转录本： 在肝中转录
成熟 mRNA： 成熟 mRNA：
1663nt 1773nt
图 18-57 小鼠淀粉酶(amy) 基因利用不同启动子产生两个不同的 mRNA
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三、真核生物DNA水平上的基因表达调控
1、染色质结构对转录的影响 2、基因扩增 3、基因重排与变换—免疫球蛋白 4、DNA甲基化与基因活性的调控
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1、染色质结构对转录的影响
在细胞分裂间期的细胞核中，染色质的形 态不均匀。根据其形态及染色特点可分为 常染色质和异染色质两种类型。
常染色质：折叠疏松、凝缩程度低，处于 伸展状态，碱性染料染色时着色浅。
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PS
DNA
初始转录本： 在唾腺中转录
外显子 S
PL 外显子 L
外显子 2 外显子 3
50b 2800bp
161bp 4500bp 205bp 327bp
初始转录本： 在肝中转录
成熟 mRNA： 成熟 mRNA：
1663nt 1773nt
真核生物基因的表达调控
细胞周期与基因表达
G1期
细胞在G1期主要合成与DNA 复制有关的蛋白质，如复制因 子等。
G2期
G2期细胞主要合成与分裂期有 关的蛋白质，如微管蛋白等。
细胞周期
真核生物细胞周期分为间期和 分裂期，不同时期基因表达DNA的复制，同 时合成组蛋白等与染色体组装 有关的蛋白质。
翻译和后翻译修饰
翻译
mRNA在细胞质中被核糖体读取并翻译成蛋白质。翻译的效率受到多种因素的 影响，包括mRNA的浓度、核糖体的数量、以及各种翻译调控因子。
后翻译修饰
新合成的蛋白质经常需要进行翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、糖基化等，以 增加其活性和稳定性。这些修饰通常由特定的酶催化，并受到细胞内环境和信 号通路的调节。
肾上腺素
02
03
甲状腺激素
肾上腺素可以激活糖原分解和脂 肪分解相关基因的表达，提高能 量供应。
甲状腺激素可以促进细胞代谢， 提高基础代谢率，同时还可以影 响神经系统的发育。
神经递质对基因表达的调控
多巴胺
01
多巴胺可以影响奖赏和愉悦相关基因的表达，与成瘾行为和心
理健康有关。
5-羟色胺
02
5-羟色胺可以影响情绪和行为，与抑郁症和精神分裂症等精神
染色质重塑
染色质重塑是基因表达调控的另一重要机制，通过改变染色质的结构和组成，影响转录因 子的结合和RNA聚合酶的活性。
microRNA的调节
microRNA通过与mRNA结合，调控靶基因的表达水平，参与多种生物学过程，如发育、 代谢和应激反应等。
02
转录水平的调控
转录因子
1 2 3
转录因子概述
葡萄糖
葡萄糖水平可以影响胰岛素的分 泌，进而影响与胰岛素相关的基 因表达。
真核细胞基因表达
真核细胞基因表达
真核细胞基因表达是指真核细胞中基因转录、转译、翻译和调控的过程。
真核细胞具有细胞核，基因组较大，其中包含了大量的非编码RNA和调控元件。
基因表达调控是通过转录因子和多种调控蛋白质进行的。
在真核细胞中，转录后的前mRNA需要通过剪接形成成熟的mRNA，然后进入细胞质，翻译成蛋白质。
翻译过程中还存在调控，如翻译后修饰、蛋白质降解等。
基因表达的细节和调节机制非常复杂，但是对于理解生物学和疾病机理非常重要。
- 1 -。
基因工程课件14 真核表达系统
单交换整合
双交换整合：置换，稳定性强
a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合
二、酵母表达系统
附加体型载体
大肠杆菌质粒，2μm质粒，酵母染色体选择标记基 因构成。
2μm 提供复制起始点和STB，使载体更稳定
拷贝数高
用于外源基因的表达
二、酵母表达系统
可以通过哪些方法增加质粒载体在酵母宿主细 胞中的稳定性，各有什么特征？
GGU (Gly/G)甘氨酸 GGC (Gly/G）甘氨酸 GGA (Gly/G）甘氨酸 GGG (Gly/G）甘氨酸
二、酵母表达系统
自主复制型质粒载体
定义：在E.coli质粒载体的基础上构建而来 复制方式：酵母基因组复制起始区,大肠杆菌质粒复制起始序列 筛选标记： E.coli +酵母 克隆位点来自E.coli质粒 转化率高、拷贝数高、不稳定
二、酵母表达系统
酵母人工染色体
ARS：酵母染色体自主 复制序列
TEL：端粒序列 CEN：着丝粒 选择标记基因
适合真核基因组的克隆与表达 研究
酵母表达系统
酿酒酵母， 1981 年 Hitzeman 等用酿酒酵母成功地
表达了人干扰素，但该系统具有一定的局限性， 缺乏强有力的启动子，分泌效率差，质粒不稳定 等。因此，人们在此基础上又寻找了新的酵母表 达系统——毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。
真核选择标记基因
cycloheximide 放线菌酮：由产生放线菌酮的放线 菌发酵液中提得的一种抗生素 ,cycloheximide 机理 是真核细胞蛋白合成抑制剂,毒性很强，现在已很 少用。
第六章 真核生物基因表达
（一）真核生物基因组DNA甲基化
1.真核生物DNA甲基化位点 真核生物DNA的mCpG是DNA甲基化的主要形式
CpG岛: 由于CpG通常成串在DNA双链对称出现，被称为~， mCpG占全部CpG的70%
76,000 ?
52,000 ?
44,000 ?
?
?
?
?
普遍 淋巴细胞 淋巴细胞 普遍 普遍
▪ 了解启动子及各个元件的特点、信息有 什么作用？
▪ 启动子有没有改造的空间呢?
▪ 双向启动子
▪ 组织特异性启动子
▪ 诱导性启动子
（二）增强子
增强子（enhancer）：又称为远上游序列，位于转录起始位点
人类基因组中免疫球蛋白基因主要片段的数量比较
V、C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞，发育 分化时，通过染色体内DNA重排把4个相隔较远的基因片段连接在一起，产生 具有表达活性的免疫球蛋白基因。
▪ 酿酒酵母接合型：
▪酵母细胞通 过交换型转 换过程改变 自己的性别。 MATa或 MATα基因 座位两侧分 别存在两个 MAT样基因 HMLα和 HMRa沉默 交配型盒。
(3)DNA去甲基化位点的特点
① DNA去甲基化位点范围和DNA酶I优先敏感区域十分 吻合
②只有一小部分CG二核苷酸对的去甲基化与基因激活有关， 它们位于对基因表达关系十分密切的序列中
▪ (4) DNA甲基化/去甲基化对基因活性调控的相对性 ① DNA甲基化程度因物种而异
DNA甲基化随进化程度的提高而增强
的上游，它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的
真核表达系统
真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。
例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
分子生物学-真核生物基因表达调控
3 基因重排与交换
将一个基因从远离启动子的地方移到距它很
Hale Waihona Puke 近的位点从而启动转录，这种方式称为基因 重排。
通过基因重排调节基因活性的典型例子是免
疫球蛋白和T-细胞受体基因的表达。
V、C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞发 育分化时，通过染色体内DNA重组把4个相隔较远的基因片段连接在一起， 从而产生了具有表达活性的免疫球蛋白基因。
发育早期：只有一个着丝点行使功能，
从头合成型甲基转移酶：催化未甲基化的CpG成 为mCpG
基因丢失
在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基
因而去除这些基因的活性。某些原生动物、 线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许 多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体， 只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直 保留着整套的染色体。
一．
基因丢失： 在细胞分化过程中，某些原生动物、线虫 、昆虫等体细胞通过丢失某些基因而除去 这些基因的活性。 马蛔虫：只有一对染色体，染色体上有许 多着丝点。
假基因
是基因组中因突变而失活的基因，无蛋白质产
物。
一般是启动子出现问题。
8.2 DNA水平的基因表达调控
1染色质水平的调节：“开放”型活性染色质
（activechromatin）结构对转录的影响
2基因扩增
3基因重排与交换
4
DNA甲基化与基因活性的调控
1 染色质状态对基因表达的调控
能相关的基因，这些基因成套组合称为基因家族。 如：编码组蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白的基因都 属于基因家族 同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为 一个基因簇(gene cluster) 。
1、简单多基因家族
真核基因表达调控讲义
真核基因转录调控（讲课内容，缺图）张俊武一．基因表达概述基因表达就是储存遗传信息的基因通过转录及翻译等步骤产生具有一定生物功能的蛋白质的整个过程。
典型的细菌基因组包括约4,000个蛋白质基因，人基因组包括约10万个蛋白质基因，但在某一时刻仅有一部分基因表达。
例如大肠杆菌中通常有5％的基因处于高水平转录活性状态。
一些基因产物需要以很大的数量存在于细胞中来行使其功能，例如蛋白质生物合成的延伸因子在细胞内含量极其丰富。
有些基因产物在细胞内的含量则很少，如修复DNA损伤的有关酶在一个细胞中可能仅含几个分子。
对于同一基因产物的需要也可能随时间而改变，例如细菌中一些代谢途径所需的酶可随食物源泉的变化或消耗而增减。
在多细胞真核生物发育过程中，一些影响细胞分化的蛋白质仅在一部分细胞中存在短暂时间。
一些具有特殊功能细胞的特异化可能极大地影响了对某种基因产物的需要，最典型的例子就是在红细胞中的血红蛋白具有极高的浓度。
总之在细胞代谢调节、细胞分化以及个体发育过程中，基因表达调节都是一个非常重要的组成部分。
正象细胞对不同蛋白质的需要变化一样，各个基因表达调控的机制也是变化的。
一些基因产物总被需要，并且它们的基因在一种生物或有机体的全部细胞中基本上以恒定的水平表达，这些基因被称作管家基因(housekeeping genes)。
例如，许多催化中心代谢途径(如柠檬酸循环)各步骤的酶的基因、肌动蛋白(actin)基因都是管家基因。
恒定的、似乎不被调节的基因表达被称作基本的基因表达(constitutive gene expression)。
实际上，基本的基因表达也是在一定的机制控制下进行的。
一些基因产物的数量在应答分子信号时增加或减少。
在特定条件下表达产物增加的基因称为可诱导(inducible)基因。
可诱导基因在特定条件下增强表达的过程叫诱导(induction)。
例如，许多编码DNA修复酶的基因，在应答高水平的DNA损伤时被诱导。
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四）外源基因在酵母菌中的表达
1、胞内表达：直接表达外源基因，
如：HBsAg的酵母重组疫苗
2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列，
pGAPZ,利用因子分泌表达
五）高表达的策略
（ 1 ）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能 力强的GAP启动子
（ 2 ）提高整合拷贝数： 可利用载体中提供的抗生素遗传标记， 以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。 （ 3 ）控制蛋白酶降解活性 ： 采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变 发酵培养基的 PH 值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均 可避免产物被降解。 （4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。
Octamer
GGCCAATCT
ATTTGCAT
CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Oct-1 Oct-2 76,000 53,000 ~ 20bp ~ 23bp ~ 10bp 20bp
kB ATF
GGGACTTTCC GTGACGT
NFkB 44,000 AFT ?
增强子(enhancer) • 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件
（2）反式作用因子(trans-acting factor)
由位于不同或相同染色体上相距较远的 基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控
元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转
录活性。
P
Trans-acting factor
DNA
转录信号1
Trans-acting factor (DNA结合蛋白）
受体细胞
据受体细胞及表达载体的不同分为3种：
• 酵母表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统 • 昆虫细胞表达系统
一、酵母表达系统
• 发酵简单、快速、便宜
• 真核生物，有翻译后修饰功能
• 可分泌表达，简化了纯化工艺
• 受体细胞安全
（一）酵母载体:
1、概念：
携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增
和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。
1、转录前水平(基因组水平) ： gene level 2、转录水平调控: transcription level
3、转录后调控: posttranscription level
4、翻译水平的调控: translation level 5、翻译后修饰: post-translation modification
• 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) 克隆大片段DNA， 2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，
可以独立复制并转录。
（1）酵母克隆载体的构建
• 酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. Yip) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染 色体，转化子稳定，但转化率极低。
1、转录前水平(基因组水平)： gene level
基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋 白修饰，DNA甲基化等
2. 转录水平调控
顺式调控元件(cis-acting element)
反式作用因子(trans-acting factor)
（1 ）顺式调控元件(cis-acting element)
酵母 复制 序列
（2）酵母表达载体
• 特点：含酵母启动子
穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外 源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细 胞中表达的载体。 • 种类：啤酒酵母表达载体
毕赤酵母表达载体：
分泌型表达载体
非分泌型表达
啤酒酵母表达载体
毕赤酵母表达载体------整合型
• 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动 子没有严格的专一性 • 无方向性（序列、位置） • 远距离作用（1-4kB）
构建载体
• 无基因特异性
• 具组织特异性
沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式
与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加 尾信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成
(3) 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)----克隆大片段DNA
由下列元件组成 酵母染色体 2umDNA的复制起始区 着丝粒序列（CEN) 四膜虫端粒DNA(TEL)
• YAC: 利用酵母的着丝粒区段（CEN ）、自动复制序列 （ARS）及四膜虫端粒DNA(TEL)构建的人工染色体 • 结构： 左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN 右臂：TEL、选择标记 • 特点：容量大（50-100replicable plasmid, YRp) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS), 可自主复制，但稳定性差 • 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因 (YIp)+酵母2μ M质粒，游离于核外存在并自主复制
酵母2μM质粒
真核启动子结构模式图
上游启动子元件
核心启动子元件
哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件
元件名称 TATA box GC box 共同序列 TATAAAA GGGCGG 名称 TBP SP-1 结合的蛋白因子 分子量 结合DNA长度 ~ 10bp ~ 20bp
30,000 105,000
CAAT box
Features of Eukaryotic gene structure and expression
（一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面
（二）真核基因表达的调控模式
真核基因表达的调控模式
( The regulatiБайду номын сангаасg model of eukaryotic gene expression)
酵母表达系统(yeast expression system)
哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression)
昆虫细胞表达系统(insect cell expression )
第一节 概述
一、真核基因组的复杂性
二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势
一、真核基因组的复杂性
1. 真核基因组巨大
大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量 级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因
2. 真核生物遗传信息复杂
原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍 体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加 了基因表达调控的层次和复杂性。
2、组成元件：遗传标记
调控序列
1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定 营养标记基因：亮氨酸（Leu）
抗生素选择标记基因：Zeocin
2）调控序列
• ARS：酵母复制起始区(点)
• 酵母启动子：常用的有:
PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶)
二）受体细胞 1.啤酒酵母：
较早使用，了解清楚
安全性高，被FDA确认为安全生物
表达量较低
过量糖基化
转化子不稳定，易发生质粒丢失
2. 毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞
• 高表达（12g/L）
• 高稳定-----载体为整合型
• 高分泌（10g/L）
三）转化
1. 原生质体法：去除厚壁 2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切 线性化 3. LiCl法：做成感受态细胞
Cis-acting factor
B gene
A gene
mRNA of A Protein A
mRNA of B Protein B
3、转录后的修饰
• 内含子的剪接
• 外显子的拼接 • mRNA的加尾和加帽
• mRNA的稳定性
4、翻译水平的调控
主要是microRNA对mRNA、tRNA 和 rRNA的调控
二、 原核表达系统的局限性
1、没有转录后的剪接和加工系统
2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基 化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白 的活性。
3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定
易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易 出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低
5、翻译后的调控
• • • • • •
切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解
第三节 真核表达系统
组成： 真核表达载体 受体细胞
真核表达载体
适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。
真核载体根据受体不同，又可分为几种：
• 酵母表达载体
• 哺乳动物细胞表达载体
• 昆虫杆状病毒表达载体
酵母双杂交系统
Yeast Two-Hybrid System
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用 也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母 双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实 验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相 互作用对真核基因转录调控影响的实验。
结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： • 起正性调节作用：启动子、增强子 • 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号
启动子
位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离 作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括