农杆菌介导转化和再生的杨树讲解

农杆菌介导法转基因杨树

摘要：

杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。

关键词：白杨；转化；农杆菌

前言

基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x grandidentata的（NC - 5339 ）作为载体的农杆菌转化体系。

有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。对

于短期循环杨树种植园的建立和管理的一个主要限制因素是缺乏一种广谱除草剂，从而有效地控制杂草(Akinymiju etal. 1982; Hansen and Netzer 1985; Nelson and Haissig 1986)。因此，生产的杨树品种抗此类除草剂具有经济吸引力。介绍草甘膦耐受性的嵌合基因(Comai et al. 1985) 杨树杂交提供了一个独特的机会对于杂草控制。野生型菌株，如杨树虫瘿上已分离出27株（基恩等人1970年生）和应变AT181（西亚基等人，1978）。最近，杨树再次作为宿主的根癌农杆菌展示瘿组织中存在的T-DNA序列（Parsons等人，1986），但是，迄今为止的根癌农杆菌还没有被成功地用作载体将外到杨属植物重要农艺性状的基因。第三，杨树是一个属森林树木的成员，其经受得起体外操纵。杨树的苗培养可以保持在体外和用于无性繁殖，从而提供了一种无菌的细菌的共培养实验中的外植体材料的来源。此外，大量的繁殖体可以迅速获得用于实验或商业目的（1978视Christie;麦科恩1985）。在本文中，我们描述了胡杨NC-5339植物外源基因系统的转移和表达。农杆菌的遗传转化使用二元的致瘤菌株突变aroA基因，编码5 - 烯醇丙酮酰莽草酸3 - 磷酸合酶（EPSP）较不敏感的除草剂草甘膦，背引入到杨树NC-5339植株。aroA基因的稳定整合和表达由Southern和Western印记分析证实。这是首次报道的同时改造再生的森林树种。

材料与方法

植物培养及再生。苗培养建立在一个杨树杂交克隆，银白杨x大齿杨（NC-5339），麦科恩（1985）所描述的。Murashige和Skoog培养基中蔗糖（30克/升），和植物琼脂（0.6％）（血清）中的最小的有机物，用于初始培养和随后的次生培养。培养基用氢氧化钾溶液将pH值调节至5.6，高压灭菌培养基20分钟在121°C. 红色苯胺染料（芝加哥），GA7培养容器，含有50毫升培养基，用于维持苗的培养。这种培养基也被用于白杨生根培养。

苗的培养是除去叶片和顶芽，并把切下的茎水平铺到新的培养基上来维持嫩腋芽每四个星期出现。

所有培养物生长在受控环境室在25°C_+2°C，采用冷白荧光灯50微摩每米每2秒(50g Em 2S)在16 h光照天为一个周期。从叶片外植体芽再生培养基（如上所述）维护培养通过添加BA（1.0毫克/升）和玉米素（ZEA）（1.0毫克/升）。高压灭菌后，冷却至50℃，羧苄青霉素（500毫克/升）（抑菌物质）和卡那霉

素（60毫克/升），（选择性抗生素），除菌过滤器，根据需要向培养基中加入。然后将该培养液分配到100×15毫米的培养皿中（35-40毫升，每盘）。

菌株。根癌农杆菌菌株LBA4404中是一种非致癌衍生物ACH5的T-DNA已被删除（赫克玛等人，1983 ）。该菌株携带一个完整的VIR区域，并可以调解引入任何T - DNA存在于植物的细菌进入。Ç 58是一个致癌的，胭脂碱生产的应变农杆菌的遗传转化（汉密尔顿和1971年秋季）。双载体引入pPMG85/587株LBA4404和C58 。此质粒携带的变形的T-DNA中，有三个嵌合基因（图1）。这些基因编码新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ'）的抗性对抗生素卡那霉素（Bevan 等人，1983; Fraley等人，1983 ; Herrera的埃斯特雷亚等，1983），两个并拼接到羧乙基精氨酸合成酶启动子（ocs- NPT Ⅱ'）（Barker等人，1983）或甘露碱合成酶启动子（mas-NPT Ⅱ'）（Barker等人，1983）。第三个基因赋予耐受除草剂草甘膦（Comai等，1983），并已接合的甘露碱合成酶启动子（主重组质粒中的aroA ）。农杆菌维持在AB固体基本培养基（Watson等，1975），补充的情况下，卡那霉素100毫克/ 1株含有pPMG85/587 。文化被重新划线每十五天。共培养从新鲜的划线板的单个菌落接种到5毫升MG / L液体培养基（奇尔顿等，1974 ），在25×150mm的培养管中，培养过夜。当时过夜培养稀释至合适的浓度（C 58 / 85分之587和C58 ; 2×10秒菌落形成单位/毫升;应变LBA4404/587/85 ：5-10×L0小号个菌落形成单位/毫升）的培养物在550nm处的吸光度的菌株测量细菌浓度。

转化的杨树NC-5339，通过以下方式获得在烟草悬浮培养细胞的存在下（Horschet人，1985）的根癌农杆菌共培养的叶片段。烟草进纸器板，制备前2天，通过移液陪替氏培养皿（100×25毫米），含有50毫升的Murashige最小的有机物介质（KC生物），补充了2,4-D（0.1到0.5毫升的烟草悬浮培养中使用毫克/升）激动素（1.0毫克/升）的盐酸硫胺素（0.9毫克/升），酸式磷酸钾（200毫克/升），Difco细菌琼脂（0.8％）。第2天，无菌滤纸的培养皿（Whatman 公司3毫米）被放置在顶部的烟草细胞。预洗涤滤纸圆片在蒸馏水中，高压灭菌在烟草悬浮介质中（如上所述），但无琼脂的。

烟草细胞悬浮液用于馈线板块维持每周转移10毫升的细胞——凝聚剂锡安到100毫升新鲜液体培养基。使用的介质为维护烟草细胞悬浮液(描述上图)是相