生物抗氧化剂清除自由基活性的研究

酸亚铁，立即混匀后加入 3.5mL 的去离子水。至于 37 ℃ 的保温
箱种 60 分钟后取出，在 536nm 波长处测定吸光度为 A3。
2.2.4 清除率的计算[4]
源自文库
清除率/%=
A2 - A1 A3 - A1
× 100
2.3 生物抗氧化剂的配制
量取 50%乙醇，分别溶解样品提取物[5（] 红景天提取物、葛根
16
自由基清除率（%） 自由基清除率（%）
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0 1
5
10
15
20
25
葛根提取物浓度（mg/mL）
图 3 葛根提取物清除自由基活性的研究
3.2.2 邻二氮菲-Fe2+还原法 分别配制了不同的浓度的葛根提取物溶液，当葛根提取物
浓度分别 1mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、 25 mg/mL 时，测量的吸光度及相应的清除率如图 4。
（1）DPPH：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-pic-
rylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydra-
zyl）分子式：C18H12N5O6 分子量：394.32 暗紫色大棱柱形晶体。
mp127～129 度（分解）。一般试剂含量不小于 98％。
食品与生物
生物抗氧化剂清除自由基活性的研究
徐超
（广西玉林市质量技术监督局，广西 玉林 537000）
【摘 要】 人体内自由基的产生与上百种疾病有着密切的联系，除正常代谢外，生存环境与生活方式中有大量促自由基产生
的因素，可导致脂质、蛋白质和 DNA 的氧化性退化、激活致癌原、抑制胞内抗氧化防御系统等。因此，有必要寻找安全有效的生物抗
510nm 处的吸光度升高，这种变化反映了抗氧化剂的抗羟基自
【第一作者】徐超（1982-），女，广西柳州人，助理工程师，研究方向：产品质量监督。
15
由基氧化作用。
2.2.2 实验试剂与设备
2.2.2.1 实验试剂
（1）磷酸盐缓冲液
称取量 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 ⋅ 12H2O 3.63g，KH2PO4
10 mg/mL、15 mg/mL 葡萄籽提取物溶液。
3 结果与分析
3.1 红景天提取物清除自由基活性的研究 3.1.1 DPPH·法
分别配制了不同的浓度的红景天提取物溶液，当红景天提 取物浓度分别为 0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、 0.5 mg/mL、0.6 mg/mL 时，测量的吸光度及相应的清除率如图 1。
2 实验方法
2.1 DPPH·法清除自由基活性的方法 2.1.1 实验原理
DPPH·法操作非常简单，不用复杂的检测仪器，是用反应体 系颜色的改变来评价试样抗氧化，DPPH·法被很多实验室用作 抗氧化剂的抗氧化能力评价方法。DPPH·是一种比较稳定的自 由基。DPPH·反应可能是 ET 机制[2]，也可能是 HAT 机制[3]，或者 是两者共同作用的结果。空间位阻效应是决定 DPPH·反应的重 要因素，DPPH·反应比较难与空间位阻大的抗氧化剂发生反应， 与空间位阻小的抗氧化性的反应机制可能不同，反应达到平衡 所用的时间也比较长。自由基因为异常的活泼，并且寿命比较 短，所以一般实验方法产生的自由基基本上不可以被精准的量 化测量，但是如果根据自由基产生的后果，例如说氧化还原产物
网络出版时间：2015-06-11 16:28 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1165.TS.20150611.1628.007.html
2015 年 6 月 第 6 期（总第 199 期）
轻工科技
LIGHT INDUSTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY
从图 2 可以看出，邻二氮菲-Fe2+还原法测定的清除率与红景 天浓度的关系，红景天提取物浓度在 0.1mg/mL 至 0.6mg/mL 与 清除率呈正相关，并且在 0.2mg/mL 至 0.6mg/mL 的浓度范围内 有比较好的线性关系。当红景天提取物溶液浓度大时，样品的 吸收效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏 度和准确度都不高，但是当清除率小于 25%测定结果的绝对误 差大，据此活性测定浓度范围在 0.4mg/mL 至 0.6mg/mL，清除率 在 36%至 72%。
从图 1 可以看出清除率与红景天浓度的关系，红景天提取物 浓度在 0.1mg/mL 至 0.6mg/mL 与清除率呈正相关，并且在 0.1mg/ mL 至 0.5mg/mL 的 浓 度 范 围 内 有 比 较 好 的 线 性 关 系 。 超 过 0.5mg/mL 后，即使红景天提取物浓度溶液的浓度增加，清除率提 高不大，而且当红景天提取物溶液浓度大时，样品的吸收效应使 背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和准确度 都不高，但是当清除率小于 25%测定结果的绝对误差大，据此活 性 测 定 浓 度 范 围 在 0.2mg/mL 至 0.5mg/mL，清 除 率 在 38% 至
从图 3 可以看出，DPPH·法测量的清除率与葛根浓度的关 系，葛根提取物浓度在 1mg/mL 至 25mg/mL 与清除率呈正相关， 并且在 5mg/mL 至 20mg/mL 的浓度范围内有比较好的线性关 系。超过 20mg/mL 后，即使葛根提取物浓度溶液的浓度增加，清 除率提高不大，而且当红景天提取物溶液浓度大时，样品的吸收 效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和 准确度都不高，但是当清除率小于 25%测定结果的绝对误差大， 据此活性测定浓度范围在 5mg/mL 至 20mg/mL，清除率在 32%至 79%。
提取物、葡萄籽提取物），分别配制成 0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.3
mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL 的 红 景 天 提 取 物 溶
液，1mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/
mL 的葛根提取物溶液，0.1mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、
酸亚铁，立即混匀后加入 2.5mL 的去离子水，最后加入 1%双氧
水 1.0mL。至于 37 ℃ 的保温箱种 60 分钟后取出，在 536nm 波长
处测定吸光度为 A1。
（2）吸取 1.5mL 的 5mM 邻二氮菲，加入 4.0mL 的 150mM，
pH=7.4 的磷酸盐缓冲液，充分混匀后再加入 1.0mL 的 7.5mM 硫
吸取红景天提取物溶液 2.0mL，加入 2.0 mL 的 0.2mmol/L
DPPH·溶液，混合均匀后放置一段时间。用无水乙醇调零，在
517nm 波长下测定吸光度（ A样品），测定 2.0 mL 红景天提取物溶液
和 2.0 mL 无水乙醇混合液的吸光度（ A对照）。最后测定 2.0mL 无
水乙醇和 2.0mL DPPH·溶液在 517nm 处的吸光度（ A空白）。清除
80
70
60
自由基清除率（%）
50
40
30
20
10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
红景天浓度（mg/mL）
图 2 红景天提取物清除自由基活性的研究
3.2 葛根提取物清除自由基活性的研究 3.2.1 DPPH·法
分别配制了不同的浓度的葛根提取物溶液，当葛根提取物 浓度分别 1mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、 25 mg/mL 时，测量的吸光度及相应的清除率如图 3。
（2）磷 酸 盐 缓 冲 液（PBS）：称 取 量 NaCl 8g、KCl 0.2g、
Na2HPO4⋅ 12H2O 3.63g、KH2PO4 0.24g，用 900mL 双蒸水溶解，加
盐酸调 pH 值至 7.4，加水定容至 1L，常温保存备用。
2.1.2.2 实验设备
分光光度计。
2.1.3 实验方法
83%。
自由基清除率（%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
红景天浓度（mg/mL）
图 1 红景天提取物清除自由基活性的研究
3.1.2 邻二氮菲-Fe2+还原法 分别配制了不同的浓度的红景天提取物溶液，当红景天提
取物浓度分别为 0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、 0.5 mg/mL、0.6 mg/mL 时，测量的吸光度及相应的清除率如图 2。
或者相关的指标的数据能够反向推导出自由基产生和它被清
除、抑制的效果。作为自由基捕捉剂的 1，1-二苯基-2 苦基肼
（DPPH·）在电子顺磁共振检测中自身就能够产生氮自由基，也
能够与抗氧化剂产生反应，DPPH 有特殊的紫色，与抗氧化剂的
作用情况能够从褪色情况反映。
2.1.2 实验试剂与设备
2.1.2.1 实验试剂
相应提高。
【关键词】
DPPH
⋅
；邻二氮菲
-F
2 e
+
；红景天提取物；葛根提取物；葡萄籽提取物
【中图分类号】 Q617
【文献识别码】 A
【文章编号】2095-3518（2015）06-15-03
1 前言
自由基，在化学上也被称作“游离基”，是含有一个不成对的 电子的原子团。体内的活性氧自由基具有一定的功能，但过多 的活性氧自由基会有破坏作用，导致人体正常细胞和组织损坏， 从而引起多种疾病，例如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤 等。另外，外界环境中阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使 得人体产生更多的活性氧自由基，这就是人体衰老和患病的根 源。自由基清除剂[1]能借助键的均裂，释放出体积小、亲合性很 强的氢自由基，被油脂自动氧化链式反应生成的自由基俘获而 生成分子态化合物，将高势能的极活泼的自由基转变为较稳定 的分子，从而中断了链式反应的传递速度，阻止了油脂被进一步 氧化。随着人们生活水平和物质文化的不断提升，人们更倾向 于选择安全性高的天然食品防腐剂，因此选用了红景天提取物、 葛根提取物、葡萄籽提取物对其自由基清除活性进行了试验，希 望通过此次研究可以为它们在天然抗氧化剂方面的开发应用提 供参考。
酸亚铁，立即混匀后加入 2.5mL 的红景天提取物溶液，最后加入
1% 双 氧 水 1.0mL。 至 于 37 ℃ 的 保 温 箱 种 60 分 钟 后 取 出 ，在
536nm 波长处测定吸光度为 A2。
（3）吸取 1.5mL 的 5mM 邻二氮菲，加入 4.0mL 的 150mM，
pH=7.4 的磷酸盐缓冲液，充分混匀后再加入 1.0mL 的 7.5mM 硫
氧化剂补充人体从食物中所摄取的抗氧化维生素的不足。此次研究分别用 DPPH ⋅ 法、邻二氮菲-Fe2+还原法测定红景天提取物、葛根
提取物、葡萄籽提取物的清除自由基和抗氧化活性，研究发现 DPPH ⋅ 法、邻二氮菲-Fe2+还原法均可以用于红景天提取物、葛根提取
物、葡萄籽提取物抗氧化性能力的测定。在一定的浓度范围内，随着样品提取物溶液浓度的提高，其抗氧化性、清除自由基的能力也
从图 4 可以看出，邻二氮菲-Fe2+还原法测量的清除率与葛根 浓度的关系，葛根提取物浓度在 1mg/mL 至 25mg/mL 与清除率 呈正相关，并且在 1mg/mL 至 20mg/mL 的浓度范围内有比较好 的线性关系。超过 20mg/mL 后，即使葛根提取物浓度溶液的浓
度增加，清除率提高不大，而且当葛根提取物溶液浓度大时，样
0.24g，用 900mL 双蒸水溶解，加盐酸调 pH 值至 7.4，加水定容至
1L，常温保存备用。
（2）邻二氮菲，硫酸亚铁，去离子水，双氧水。
2.2.2.2 实验设备
分光光度计，保温箱。
2.2.3 实验方法
（1）吸取 1.5mL 的 5mM 邻二氮菲，加入 4.0mL 的 150mM，
pH=7.4 的磷酸盐缓冲液，充分混匀后再加入 1.0mL 的 7.5mM 硫
率的计算：DPPH·清除率/%=（1-
A
- A 样品
对照
A空白
）。
2.2 邻二氮菲 -Fe2+ 还原法
2.2.1 实验原理
过氧化氢产生的羟基自由基将邻二氮菲-Fe2+溶液氧化为邻
二氮菲-Fe3+后，它在 510nm 处最大吸收峰消失；加入抗氧化剂溶
液后，因为抗氧化剂溶液具有消除羟基自由基的作用，所以使在