毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)
运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中的表达
微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
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结果和讨论
重组质粒 ’()*$+,-./0! 的构建
扩增片段经 &’( @! 和 )(* ! 酶切后， 克隆至巴 采用反转录 $?@ 法扩增 "#$% . 基因， 斯德 毕 赤 酶 母 的 载 体 1$A?BC 中， 构 建 成 1$A?BC#DEFG.， 内 含 受 %HD. 启 动 子 调 控 的 （图 .） 。 "#$% . 基因 & " & 定点突变 扩增获得 />BJK 的 "L% 片段 （图 ;） ， 通 经过三轮 $?@ 将 "#$% . 中 A,*.5I 突变为 %,).5I ， 过序列测定分析， 确证突变位点与设计的目标位点一致。转化大肠杆菌， 随机筛选 .I 个 阳性克隆子。经酶切鉴定含有目标片段， 再经过大量培养、 提取、 纯化获得含有突变的 "#$% . 基因的重组质粒。
536
微
生
物
学
报
53 卷
重组质粒 !"#$%&’()*+, 经 !"# !切割， 采用表达系统推荐的原生质体法转化巴斯德 毕赤氏酵母 -.,,/， 在不含组氨酸的再生平板 012 上随机挑选 344 个克隆子。经同步培 养后， 鉴定转化子的 -5,6 抗性， 从中挑选具有较高抗性的转化子， 并在含有 022’木聚糖 （0789:;< 2=><<>9*? 2<@7 0’1’()<9*， 的平板上培养鉴定。在研究过程中发现突变 .>A89 公司） 株 #,/BC 的 -5,6 抗性浓度为 4D/8A E 8F， 远低于亲本的 -5,6 抗性浓度 ,DG/8A E 8F。由于 因而也反映了重组质粒的整 -5,6 抗性水平大致依赖于所整合的细菌卡那霉素基因数目， 合拷贝数。由此可知， 突变株的整合拷贝数低于亲本。 !"# 培养和纯化 （突变株） 和未突变的 $%&’ , 基因的转化子 （亲本 将含有突变的 $%&’ , 基因的转化子 或出发菌株） 在 2HHI 培养基上摇瓶培养， 并每天补加 /8F E F 的甲醇诱导表达。 测定摇瓶培养上清液中的木聚糖酶含量， 发现突变株的产酶单位远远高于出发菌株 的产酶单位。在以考马斯蓝染色的突变株上清液蛋白凝胶电泳中能非常清晰地看到一条 约 J/K1 的谱带， 而亲本则很难辨认 （图 J） ， 这表明突变株木聚糖酶的分泌表达量远高于 亲本； 但同时发现突变株的粗酶液很快地丧失活力， 考虑到高密度发酵胞外蛋白浓度很高 时， 毕赤氏酵母分泌的蛋白酶浓度也相应提高， 分泌的外源蛋白会遭到一定程度的降解， 因而有必要提纯木聚糖酶。
毕赤酵母发酵产木聚糖酶条件研究
毕赤酵母发酵产木聚糖酶条件研究
王涛;万红贵;蔡恒;袁建锋
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2009(000)007
【摘要】对产木聚糖酶的毕赤酵母进行5L罐发酵研究,确定了5L罐发酵的最佳种龄是24h,最佳接种量是10%.通过对pH值、搅拌转速、温度、空气流量进行正交设计试验,得出结论:pH值和温度是影响产酶的主要影响因子,并结合实际情况,得到5L罐发酵产木聚糖酶的工艺条件:pH值为5.5,温度为30.0℃,空气流量3L/min,搅拌转速为300r/min,发酵130h,毕赤酵母发酵产木聚糖酶的酶活为2780U/mL.【总页数】4页(P86-89)
【作者】王涛;万红贵;蔡恒;袁建锋
【作者单位】南京工业大学,制药与生命科学学院,江苏,南京,210009;南京工业大学,制药与生命科学学院,江苏,南京,210009;南京工业大学,制药与生命科学学院,江苏,南京,210009;南京工业大学,制药与生命科学学院,江苏,南京,210009
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925
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重组毕赤酵母工程菌产木聚糖酶酶学性质的研究
重组毕赤酵母工程菌产木聚糖酶酶学性质的研究
李富伟;汪勇;汤海鸥
【期刊名称】《中国畜牧杂志》
【年(卷),期】2009(045)003
【摘要】采用DNS还原糖法研究基因工程茵毕赤酵母产木聚糖酶的酶学性质.结果表明:该木聚糖酶具有良好的热稳定性;最适pH为4.5,在pH 3.5～7.0条件下均能保持较高的酶学活性,且对不同酸碱pH环境具有较强的耐受性;内源性蛋白酶对该木聚糖酶的活性影响较小;室温25℃下贮存12个月,该酶活性保持在80%左右;在4.0%仔猪预混料中贮存12周,酶活存留仍达91.4%以上,表现出良好的贮存稳定性.
【总页数】4页(P43-45,61)
【作者】李富伟;汪勇;汤海鸥
【作者单位】挑战生物技术有限公司,北京,100081;挑战生物技术有限公司,北京,100081;挑战生物技术有限公司,北京,100081
【正文语种】中文
【中图分类】S816.79
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非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化
非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化蓝娜娜;张薷月;苏然;杨倩;张建国【摘要】以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶.结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600.甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9％.联合0.5％甲酸铵和0.5％山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍.这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白.%Komagataella phaffii is a famous host for heterologous protein expression.However,methanol is needed as inducer and lead to toxic and explosive danger when it is used at large amount of industrial scale.Therefore,non-methanol inducer is urgent needed and thus becomea hot topic in this research field.In this research,a recombinant Komagataella phaffii expressing xylanase was used to explore non-methanol inducer.The conditions of methanol induction were optimized to obtain 3 403.8 U/mL xylanase,and 97.5 U/mL OD600 specific xylanase.40.9％intensity of AOX1 promoter under methanol induction was obtained under O.5％ ammounim formate induction.And 2 032.0 U/mL xylanase was obtained at the condition of O.5％ ammonium formate and 0.5％ sorbitol addition per 24 h,which was 1.54 fold of AOX1 promoter intensity at the condition of methanol induction.Therefore,ammonium formate combinedwith sorbitol was an efficient inducer for heterologous protein expression of Komagataella phaffii.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)003【总页数】7页(P8-14)【关键词】重组毕赤酵母;木聚糖酶;甲酸铵;混合碳源诱导【作者】蓝娜娜;张薷月;苏然;杨倩;张建国【作者单位】上海理工大学医疗器械与食品学院,食品科学与工程研究所,上海,200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,食品科学与工程研究所,上海,200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,食品科学与工程研究所,上海,200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,食品科学与工程研究所,上海,200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,食品科学与工程研究所,上海,200093【正文语种】中文木聚糖酶是一种广泛用于食品、饲料、造纸工业的酶。
一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法
一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法植物纤维素富含木聚糖，这是一种可溶于水的多糖，可以提供糖分和能量给生物体。
而木聚糖酶则可以将木聚糖分解为各种单糖，因此在生物制造、化学和环境领域有着广泛的应用。
本文讨论了一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法。
首先，我们需要了解什么是毕赤酵母。
毕赤酵母，也称“木质素分解真菌”，是一种在自然环境中广泛存在的真菌。
它主要生长在植物表面、土壤和水中，可以分解植物纤维素和木质素。
毕赤酵母通过培养和生长，可以大量生产木聚糖酶。
毕赤酵母固态发酵的方法是种植毕赤酵母菌株在物理或化学反应器内，以自然或添加的固态基质为生长基质进行发酵。
该方法比传统的液体发酵方法更加高效，环保和经济。
目前，毕赤酵母固态发酵已经被证明是一种可行的生产木聚糖酶的方法。
接下来，我们将详细介绍毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的步骤。
1. 筛选毕赤酵母菌株用一定方法筛选出适合固态酵素生产的毕赤酵母菌株。
在此过程中，考虑到毕赤酵母的生长条件需要有更好的适应性，因此将根据原始环境，筛选生长适应性更强的毕赤酵母菌株。
2. 选取适合的基质调配好相应的培养基，选择适合的固态基质，为毕赤酵母生长和繁殖提供营养，促进木聚糖酶的产生。
同时要确保基质的来源和化学成分、水分、酸碱度都能达到适宜的水平，以保证所生产出的木聚糖酶的纯度和活性。
3. 倒放法在倒放法中，先将经过有效灭菌处理的基质填充到反应器中，然后加入所筛选出的毕赤酵母菌株。
接着，进行表面打平，以保持反应器顶部平整。
4. 发酵条件使反应器维持一定的温度和湿度，具体的温度范围和湿度数值取决于毕赤酵母菌株和所选取的基质类型。
同时，要保证反应器内部通风良好，这可以帮助加速生长和减少气泡的产生以及发酵筛选条件的优化。
5. 收取、组织提取与测定当反应到达一个指定的时间段后，可以进行对所生产出的木聚糖酶的收获。
在此过程中，采取先将基质采获，然后进行适当的干燥以控制其湿度量，并用适量的缓冲液提取酵素，接着才作为酵素来为后续项目的进行提供所需的需要。
木聚糖酶XynG1-1在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化
培 养 时 间 。在 此 基 础 上使 用 Ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ — Ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｔ 软件进行 Ｂ ｏ ｘ — Ｂ ｅ ｈ ｎ ｋ ｅ ｎ实 验 设 计 ， 通 过 响 应 面 分 析 得 出优 化 的 发 酵 培
养条件 为： 甲醇 含 量 ２ ． ２ ８ ％， 培养 时间 ３ ７ ． ２ ９ ｈ ， 生物素 ４ ｍ ｇ ／ Ｌ ， 酵母粉 ２ ０ ｇ ／ Ｌ ， 蛋 白胨 ２ Ｏ ｇ ／ Ｌ， Ｙ Ｎ Ｂ ３ ０ ｇ ／ Ｌ ， 装 液 量１ ０ ０ ｍＬ ／ Ｌ ， 转速 ２ ５ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ 、 温度 ２ ８℃ 、 磷 酸缓冲液 ｐ Ｈ ６ ． ０ 。经实验验证 ， 优 化 后 的培 养 条 件 下 胞 外 重 组 酶 活 达到 ７ ０ ７ ． ２ Ｉ Ｕ ／ ｍＬ ， 与响应面预测结果 一致 ， 较优 化前 木聚糖 酶酶 活提 高 了７ ． ９倍 ， 较 原始 菌株 产酶 量提 高 了
研究 最为 广泛 的半 纤维 素酶 ， 也是 一 种重要 的工业 用
酶， 在造纸、 食品、 纺织、 饲 料 等传 统 工 业 领 域 具 有 广 阔 的应用 ， 随着 生 物 技术 的不 断 发 展 ， 木 聚 糖 酶 的应 用领 域不 断扩 大 ， 其 在 医药 、 环境 和能 源 等 方 面 的应
１ （ 天津 科 技 大 学 生 物 工 程 学 院 ， 天津， ３ ０ ０ ４ ５ ７ ）
２ （ 中 国科 学 院 天 津 工 业 生 物 技 术 研 究 所 ， 工 业 酶 国家 工 程 实 验 室 ， 天津 ， ３ ０ ０ ３ ０ ８ ） ３ （ 中 国科 学 院 天 津 工 业 生 物 技 术 研 究 所 ， 天 津 工 业 生 物 系统 与过 程 重 点 实 验 室 ， 天津 ， ３ ０ ０ ３ ０ ８ ）
木聚糖酶生产及酶学性质的研究
木聚糖酶生产及酶学性质的研究一、本文概述木聚糖酶是一类能够水解木聚糖及其相关多糖的酶类，广泛存在于自然界中，尤其是在植物、微生物和动物体内。
由于其在生物质转化、食品加工、饲料工业以及医药等领域的重要应用价值，木聚糖酶的研究与生产日益受到关注。
本文旨在全面综述木聚糖酶的生产方法、纯化技术以及酶学性质的研究进展，以期为木聚糖酶的进一步研究和应用提供理论支持和实践指导。
本文将对木聚糖酶的生产方法进行详细阐述。
这包括从天然来源中提取木聚糖酶，以及通过微生物发酵、基因工程等生物技术手段生产木聚糖酶。
在此基础上，还将探讨不同生产方法的优缺点，以及影响木聚糖酶产量的关键因素。
本文将关注木聚糖酶的纯化技术。
纯化是获得高质量、高活性木聚糖酶的关键步骤，本文将介绍常见的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等，并分析各方法的优缺点及适用范围。
本文将重点研究木聚糖酶的酶学性质。
这包括木聚糖酶的分子量、最适pH值、最适温度、动力学参数等基本性质，以及酶的稳定性、抑制剂和激活剂等影响因素。
通过对这些酶学性质的研究，可以更深入地了解木聚糖酶的作用机制和催化性能，为其在各个领域的应用提供理论依据。
本文旨在通过系统研究木聚糖酶的生产及酶学性质，为木聚糖酶的进一步研究和应用提供全面、深入的理论支持和实践指导。
二、木聚糖酶的生产方法木聚糖酶作为一种重要的工业酶，其生产方法主要包括微生物发酵法、化学合成法和基因工程法。
其中，微生物发酵法因其产量高、成本低、条件温和且易于工业化生产等优点，成为目前木聚糖酶生产的主要方法。
微生物发酵法生产木聚糖酶主要利用能够产生木聚糖酶的微生物，如真菌、细菌和放线菌等，通过优化培养基成分、发酵条件和菌种选育等手段，提高木聚糖酶的产量和活性。
目前，黑曲霉、米曲霉和里氏木霉等真菌是木聚糖酶的主要生产菌种。
在发酵过程中，碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养成分对木聚糖酶的产量和活性具有重要影响。
常用的碳源包括木聚糖、葡萄糖、果糖等，氮源则包括蛋白胨、酵母粉、豆饼粉等。
毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶条件研究
108 2009V ol 135No 12(Tot a l 254)毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶条件研究王涛,万红贵,蔡恒(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京,210009)摘 要 用麦麸、米糠农业废弃物作为主要原料生产木聚糖酶,对毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶的条件进行研究。
结果表明,最适产酶条件:以质量浓度20%的麦麸作为碳源,4%酵母浸膏作为氮源,调节初始p H 值515,培养温度30℃,摇瓶发酵装液量6%,培养时间130h ,在此条件下毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶最高活力达到2192IU/mL 。
关键词 毕赤酵母,木聚糖酶,发酵条件第一作者:硕士,助理工程师。
收稿日期:2008-11-24,改回日期:2008-11-26 木聚糖酶(xylanase )[EC 3121118]是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称,是木聚糖降解酶系中最关键的酶。
木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等行业被广泛应用,前景十分看好。
随着人们对木聚糖酶研究的不断深入,现今已报道产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉、青霉和木霉等,其中人们研究和应用最多的是细菌、曲霉和木霉生产木聚糖酶[1]。
目前国际上研究工作主要集中在对微生物产木聚糖酶的诱导与调节机理研究,以及酶的提纯、鉴定方法,木聚糖酶基因分子的克隆和表达[2～4]等。
我国对木聚糖酶的研究主要集中在产木聚糖酶优良菌株的筛选和驯化,木聚糖酶的纯化和理化性质的研究[5,6]。
由于液体输送方便,便于机械化操作,产品易于提取精制,液态发酵生产木聚糖酶将成为今后发展方向。
本文重点对毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶的培养基进行选择和优化,对产酶条件进行优化研究,取得了较好的结果。
1 材料与方法111 菌种产木聚糖酶毕赤酵母(Pichi a p astoris )菌株,由南京工业大学菌种保藏室提供。
112 主要原料和溶液D 2木糖,木聚糖均购自Sigma 试剂公司;麦麸,米糠经过风干粉碎制得;DNS [7]溶液、柠檬酸缓冲液、木糖母液、木糖标准液、木聚糖底物溶液为实验室配置。
毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化
70
江 西 化 工
2009 年第 1 期
表 2 不同氮源对产酶的影响
氮源 种类
牛肉膏
酵母 浸膏
蛋白胨酵蛋母白膏胨+
尿素
硫酸铵
酶活
(IU·ml - 1) 796 978 528
510
217 284
从实验结果可以看出 ,有机氮源明显优于无机氮 源 ,其中酵母浸膏可使酶活接近 1000 IU/ ml ,加之牛肉 膏价格因素 ,因此选用酵母浸膏作为氮源进行发酵 。 2. 3 正交试验
表 4 正交实验结果及分析
实验号 温度 接种量 pH
甲醇 实验 浓度 结果
1
1
1
1
1
1086
2
1
2
2
2
1509
3
1
3
3
3
1004
4
2
1
2
3
1410
5
2
2
3
1
1133
6
2
3
1
2
1308
7
3
1
3
2
1154
8
3
2
1
3
1085
9
3
3
2
1
1256
ห้องสมุดไป่ตู้
均值 1 1199. 667 1216. 667 1159. 667 1158. 333
2009 年 3 月
毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化
71
3 小结 本研究通过对毕赤酵母菌株产木聚糖酶发酵条件
进行了研究 ,得到该工程菌最佳碳源为麸皮 ,最佳氮源 为酵母膏 ,通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养 条件为 30 ℃、接种量 10 %、初始 pH5. 5 、初始甲醇含量 1. 0 % ,并确定了甲醇最佳诱导时间为 18h。该酶的耐 热稳定最高为 70 ℃。
《重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂工艺优化》
《重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂工艺优化》一、引言随着生物技术的飞速发展，酶制剂在食品、饲料、纺织、造纸等众多领域的应用越来越广泛。
木聚糖酶作为一种重要的工业酶制剂，其生产过程及产品性能的优化显得尤为重要。
毕赤酵母作为一种常用的表达外源蛋白的宿主细胞，其生产木聚糖酶具有许多优势。
本文旨在通过对重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂工艺的优化，提高木聚糖酶的产量及产品质量，以满足市场需求。
二、材料与方法1. 材料本实验采用重组毕赤酵母菌株，具有表达高活性木聚糖酶的能力。
此外，实验还涉及到各种培养基、试剂等材料。
2. 方法（1）对重组毕赤酵母的培养条件进行优化，包括温度、pH 值、培养基成分等；（2）对发酵过程中的关键参数进行监测与控制，如溶氧量、菌体生长曲线等；（3）对木聚糖酶的提取、纯化及干燥工艺进行优化，以提高酶的纯度和活性；（4）采用高效液相色谱、酶活性测定等方法对优化后的工艺进行评估。
三、实验结果1. 培养条件优化结果通过对温度、pH值、培养基成分等条件的优化，发现最佳的培养条件为：温度30℃，pH值为 5.5，培养基中葡萄糖浓度为4%。
在此条件下，菌体的生长速度及木聚糖酶的产量均得到显著提高。
2. 发酵过程关键参数控制结果通过对发酵过程中的溶氧量、菌体生长曲线等关键参数进行监测与控制，实现了对发酵过程的精确调控。
这有助于提高木聚糖酶的产量及产品质量。
3. 提取、纯化及干燥工艺优化结果通过对木聚糖酶的提取、纯化及干燥工艺进行优化，显著提高了酶的纯度和活性。
此外，优化后的工艺还提高了酶的稳定性，使其在贮存及运输过程中损失更小。
4. 工艺评估结果通过高效液相色谱、酶活性测定等方法对优化后的工艺进行评估，发现优化后的工艺在提高木聚糖酶的产量、纯度及活性方面均取得了显著成效。
此外，优化后的工艺还降低了生产成本，提高了经济效益。
四、讨论通过对重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂工艺的优化，我们成功提高了木聚糖酶的产量及产品质量。
毕赤酵母产木聚糖酶的动力学及流加策略
毕赤酵母产木聚糖酶的动力学及流加策略江学斌;林健聪;梁世中【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)012【摘要】为优化发酵工艺，通过单罐恒化培养对组成型毕赤酵母X-33产木聚糖酶XYL1的动力学进行了研究，并探讨了比生长速率与菌体生产率和产物生产率的关系．基于动力学研究，在50 L发酵罐中采用分段控制工艺表达XYL1．结果表明：比生长速率与葡萄糖浓度的关系基本符合Monod方程，最大比生长速率为0．35 h-1，饱和常数为0．38 g/L；当比生长速率介于0.024～0．212之间时，XYL1生成动力学模型可用一元二次方程描述；比底物消耗速率与比生长速率呈线性关系；最佳稀释速率为0．316 h-1，实验预测的最大菌体生产率为7.509 g/（L·h）；当产物生产率最大时，比生长速率达0．156 h-1；最终发酵菌湿重达（415±12）g/L，酶活达（2788±85）IU/mL，实现了XYL1的高效表达．%In order to optimize the fermentation process of constitutive Pichia pastorisX-33 for producing xylanase 1 (XYL1 ),the fermentation kinetics during the single-tank chemostat cultivation was investigated,and the relation-ship between the specific cell growth rate and the cell productivity as well asthe product yield was discussed. Then,based on the fermentation kinetics,batch control scheme was adopted to express XYL1 in a 50-L fermenta-tion tank.The results indicate that (1 )the relationship betweenthe specific cell growth rate and the glucose con-centration basically accords with the Monod equation,with a maximum specific growth ratevalue of 0.35 h-1 and a saturation coefficient value of 0.38 g/L;(2)when the specific cell growth rate ranges from 0.024 to 0.212,the ki-netic model of XYL1 formation can be described using a quadratic equation with one unknown;(3 )the specific substrate consumption rate is linear to the specific cell growth rate;(4)the optimal dilution rate is 0.316 h-1 and the maximum volumetric cell productivity is 7.509g/(L·h);(5)the specific cell growth rate achieves 0.156h-1 when the product yield reaches its maximum;and (6)after fermentation,the wet weight of cells and the xylanase activity achieve (415 ±12)g/L and (2788±85)IU/mL,respectively,which means that XYL1 is successfully ex-pressed with high efficiency.【总页数】6页(P115-119,124)【作者】江学斌;林健聪;梁世中【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】S216【相关文献】1.重组毕赤酵母产a-葡聚糖酶甲醇流加控制的研究 [J], 梁达奉;吴兆鹏;曾练强;黄曾慰;李锦荣;陈龙军;张远平;余林2.角毛壳茵木聚糖酶基因xyn24在毕赤酵母中的高效表达及产酶的固定化研究 [J],王艳君;杨谦3.毕赤酵母流加培养诱导生产植酸酶的流加控制策略 [J], 金虎;肖杰;段生兵;郑志永;史仲平4.毕赤酵母发酵产S-腺苷蛋氨酸的甘油-甲醇混合流加策略 [J], 肖安风;许海琴;倪辉;杜希萍;蔡慧农5.毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件优化及其酶学特性研究 [J], 徐志旭;袁丽娟;卢洪栋;潘春梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂工艺优化》
《重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂工艺优化》摘要：本文主要研究重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂的工艺优化问题。
通过实验，探索了生产过程中的关键参数对木聚糖酶活性和产量的影响，并对生产过程中的各个阶段进行了系统性的优化，以期达到提高木聚糖酶的产量和质量，降低成本的目的。
一、引言随着生物技术的发展，利用毕赤酵母生产木聚糖酶已经成为生物工程领域的一个重要研究方向。
木聚糖酶在饲料、食品、纺织、造纸等行业中有着广泛的应用。
因此，优化重组毕赤酵母生产木聚糖酶粉剂的工艺，对于提高酶的产量和活性，降低生产成本，具有重要的现实意义。
二、文献综述近年来，国内外学者在毕赤酵母生产木聚糖酶方面取得了显著的进展。
通过对发酵条件、培养基成分、表达系统等方面的研究，提高了木聚糖酶的产量和活性。
然而，在生产过程中仍存在一些问题，如产酶速度慢、酶活性不稳定等。
因此，需要进一步优化生产工艺，以提高木聚糖酶的生产效率和产品质量。
三、材料与方法1. 材料：选取合适的重组毕赤酵母菌株、优化培养基成分和发酵条件。
2. 方法：通过单因素实验和正交实验，探索发酵温度、pH值、接种量、培养时间等关键参数对木聚糖酶产量和活性的影响；通过响应面分析法对关键参数进行优化；采用高效离心、喷雾干燥等工艺对毕赤酵母进行后处理，得到木聚糖酶粉剂。
四、实验结果与分析1. 关键参数对木聚糖酶产量和活性的影响（1）发酵温度：实验结果表明，适宜的发酵温度为XX℃，此时木聚糖酶的产量和活性达到最佳。
（2）pH值：pH值对木聚糖酶的产量和活性也有显著影响。
实验发现，当pH值为XX时，木聚糖酶的产量和活性达到最高。
（3）接种量：接种量的增加可以提高毕赤酵母的生长速度和产酶速度。
然而，过高的接种量会导致营养成分的快速消耗，影响木聚糖酶的产量和活性。
因此，适宜的接种量为XX%。
（4）培养时间：随着培养时间的延长，毕赤酵母的产酶量逐渐增加。
然而，过长的培养时间会导致营养成分的浪费和细胞自溶，影响木聚糖酶的活性。
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX ——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
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重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验
一、实验目的
1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。
2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。
3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。
二、毕赤酵母简介
甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
CH 3OH Targeted Protein
CO 2
甲醇代谢途径
与大肠杆菌等原核表达系统相比，毕赤酵母作为一种低等真核生物，除了具有遗传操作简单、细胞生长快、易于培养等原核生物的特点外，又具有真核生物完整的蛋白表达、正确加工和修饰功能，能有效克服大肠杆菌系统表达蛋白过程中存在的不足；而与高等哺乳动物细胞相比，又具有产量高、培养成本低、产物的分离纯化简单等优点。
因此，毕赤酵母表达系统因其具有表达效率高、外源基因遗传稳定、易实现高密度培养、产物可分泌和蛋白翻译后加工等众多其它表达载体所无法比拟的优点，已成为近年来极受青睐的外源蛋白表达宿主，受到越来越多的重视和利用。
截止2005年，已有500多种外源蛋白通过毕赤酵母表达系统得到克隆表达，这些外源蛋白产品涉及食品、饲料、纺织和医药品等关系国计民生的多个行业。
然而，要实现众多新的外源蛋白产品在工业发酵罐水平下大规模商业化生产，除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外，利用过程控制的方法和手段，最大限度地提高生物反应器中基因工程菌的总生物量，发挥菌种的最大生产潜力，提高单位体积培养液中目标蛋白的表达水平是实现大规模、商业化重组蛋白生产、提高生产效率的一个关键因素。
三、毕赤酵母生产表达外源蛋白的发酵过程
一般而言，毕赤酵母高密度流加培养生产表达外源蛋白过程由甘油分批培养、甘油流加培养和甲醇诱导表达三个不同阶段构成。
甘油分批培养的目的是为了积累一定的生物量，同时抑制AOX启动子及外源蛋白表达；甘油流加培养是通过限制性的甘油流加，进一步增加生物量，尽可能地获得高细胞浓度，同时解除过量甘油对AOX 启动子的抑制作用，为细胞进入诱导期作准备；甲醇诱导表达阶段是通过添加诱导剂甲醇，实现AOX高水平转录和外源蛋白的高效表达。
四、木聚糖酶简介
木聚糖是植物细胞壁的主要成分之一，属于非淀粉多糖。
作为半纤维素的一种，在自然界中是含量仅次于纤维素的可更新多糖，存在于各种陆生植物的几乎所有部位.它从仅由β-1，4糖苷键连接的多聚糖线形分子到以α-糖甘键形成取代基支链的高度分枝的异质多糖，结构变化的范围很大。
通常，木聚糖以异质多糖形式存在并与纤维素结合在一起。
木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶。
属于水解酶类，包括内切木聚糖酶、
外切木聚糖酶和木糖苷酶三种。
内切木聚糖酶能随机切断木聚糖主链上的木聚糖苷键，生成分子量不同的木寡糖；外切木聚糖酶则从木聚糖非还原性末端切下单个的D-木糖；而木糖苷酶则水解木寡糖生成D-木糖，且仅能水解木二糖。
三者酶解作用产生的D-木糖可以被动物吸收和利用。
近年来对木聚糖酶的研究发现，它应用于饲料中提高了饲料营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产与抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种环保添加剂，在发展环保型畜牧业中具有十分重要的意义与价值。
五、毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验方案
1.培养基
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20。
甘油生长培养基(g/L)：甘油20 mL/L，MgSO4 1，K2SO4 1，(NH4)2SO4 5，CaSO4 0.1，H3PO4 2% (v/v)，PTM1 10 mL/L，KOH 20，pH 6.0。
甲醇诱导培养基(g/L)：甲醇10 mL/L，MgSO4 1，K2SO4 1，(NH4)2SO4 5，CaSO4 0.1，H3PO4 2% (v/v)，PTM1 10 mL/L，KOH 20，pH 6.0。
PTM1组成(g/L)：CuSO4·5H2O 6g，NaI 0.08g，MnSO4·H2O 3g，Na2MoO4 0.2g，H3BO3 0.02g，CoCL2 0.5g，ZnCL2 20g，FeSO4·7H2O 65g，H2SO4 5mL，生物素0.2g
培养基配置要求：
1)KOH 等其它试剂溶解后在灭菌前加入；
2)PTM1、调pH用氨水和甲醇在灭菌后、接种前添加。
3)调pH用氨水的用量需提前确定。
2. 操作步骤
如图1：
250mL 摇瓶种子培养（30 °C ，220rpm ，24h ）
每瓶种子培养基体积25mL
250mL 摇瓶甲醇诱导培养（30 °C ，220rpm ）
每瓶甲醇诱导培养基体积25mL
离心（2000rpm ×2min ）收集菌体，将菌体转入
等体积诱导培养基中进行诱导培养
8000rpm ×5min ）后
72h （3d ）
图1 毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验操作流程图
3. 分析检测
1) 细胞浓度的测定
采用比浊法，使用紫外分光光度仪进行测定。
将从摇瓶中所采集的样品经适当稀释（控制吸光度在0.1-0.7），测定其在600nm 下的吸光度OD600。
2) 发酵上清液样品蛋白浓度测定(考马斯亮蓝比色法)
原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0~1000mg 范围内，蛋白质-色素结合物在595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定A595。
试剂配制
(1) 标准蛋白质溶液称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成1g/L的原液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
操作步骤
标准曲线的制作
取6支带塞试管，编号后，按下表所示加入相应试剂：
盖上塞子，摇匀。
放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在1h内完成)。
以牛血清白蛋白含量(g)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
发酵上清液样品制备及检测
吸取经适当稀释的待测发酵上清液样品1.0mL于比色管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，25℃放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。
六、思考题
1.为分析酵母生长和产物生成要求分析做三个平行，试估算需要多少分析试剂，需
要多少一级种子瓶、二级种子瓶和发酵瓶，以及各需要多少基础培养基和补料甲醇。
2.根据你的实验结果，解释酵母生长曲线的变化趋势。
3.根据你的实验结果，解释产物生成曲线的变化趋势。
4.调pH用氨水的用量为什么需提前确定？。