毕赤酵母的电转化方法

Transformation of Pichia pastoris GS115
毕赤酵母电转化方法
电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。

线性化质粒DNA对Pichia pastoris GS115的转化
一、菌体的准备：
（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；
YPD培养基配方：注意高温灭菌的温度
1 L培养基：900 mL水中加入10 g Yeast extract, 20 g peptone，20 g葡萄糖；
定容至1L，在115o C条件下灭菌25 min；
（2）取100~500μl的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的250 mL三角摇瓶中，28~30℃、180 rpm培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；
（3）将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用20 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
（4）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
（5）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的1 M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；（6）按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；
（7）备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。

二、电击转化：
（8）将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10 μl TE溶液(或灭菌ddH2O)中，加入5μl ssDNA (ssDNA需要在沸水中煮5 min变性，然后迅速转移到冰上，放置5 min 使之成为单链状态)，与80 μl的上述步骤6所得的感受态菌体混匀(轻弹混匀)，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
（9）将电转化杯冰浴5min；
（10）电击：电压1.5kV；电容25μF；电阻200－400Ω。

电击时间为10 msec。

（11）电击完毕后，加入1ml 4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至1.5ml的EP管中；
（12）将菌体悬液涂布于MD平板上，如果菌液浓度高，可涂布两个平板；（13）将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现，大约3－4天。

MD平板制备方法：
MD培养基：2%葡萄糖，105℃灭菌30min，固体培养基添加1.5%琼脂粉。

灭菌完毕后无菌操作加入1/10体积的13.4% YNB (酵母氮碱，无硫酸铵)和4×10-5% 生物素。

YNB和生物素需要过滤除菌，不能灭菌。