(完整word版)植物内生菌DNA提取方法
菌dna提取方法
菌dna提取方法
菌DNA提取方法主要有以下几种常用的方法：
1. 热裂解法：将菌株经过培养后，取一部分菌体加入到含有蛋白酶K和SDS等裂解液的管内，经过高温加热和高速离心等步骤，将细胞裂解，使DNA释放到溶液中。
2. 真菌细胞壁裂解法：对于真菌等含有较坚硬的细胞壁的菌株，可以先用混合酶或纤维素酶等酶解细胞壁，然后再用热裂解法或理化方法提取DNA。
3. CTAB方法：CTAB（盐基洗脱法）常用于提取高质量的食管菌和黄杆菌等高GC含量的菌株DNA。
首先，将菌体经过裂解后，使用CTAB裂解液中的盐离子与DNA结合形成沉淀，然后通过洗脱步骤将DNA纯化。
4. 醋酸盐方法：醋酸盐方法适用于提取低GC含量的菌株DNA。
将菌体经过裂解后，通过添加醋酸盐裂解液，使DNA与醋酸和盐结合成为可溶性复合物，后续通过酒精沉淀等步骤将DNA沉淀出来。
5. 商业化基因提取试剂盒：市面上还有许多商业化的基因提取试剂盒，这些试剂盒提供了一套完整的操作流程和试剂，能够方便快速地提取和纯化菌DNA。
不同的菌株和研究目的可能需要使用不同的提取方法，因此在选择提取方法时需
要根据具体情况进行选择。
植物DNA的提取
植物DNA的提取（SDS法）
1．将离心管中加入提取缓冲液
2．将研钵洗净灭菌，将-80度存放的植物材料在液氮中迅速研磨成粉末；
3．将粉末放入已有提取缓冲液的离心管中，摇匀；
4．加入60ul（1/10体积）的20%SDS溶液，充分混匀；
5．65度保温30分钟；
6．冷至室温后加入220ul（1/3体积）的5M KAc溶液，充分混匀，冰上放置30分钟以沉淀蛋白和多糖；
7．室温，13,200rpm离心20分钟，取上清750ul；
8．离心管中加入750ul氯仿，充分混匀，离心12,000rpm，10分钟；
9．取600ul上清加入600ul氯仿，充分混匀，离心12,000rpm，10分钟；
10．取500ul上清，加入1ml（2倍体积）无水乙醇沉淀核酸，混匀至于-20度放置30分钟；11．低速（8000rpm）离心10分钟收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，洗3次；
12．真空抽干3分钟，溶于100ul灭过菌的去离子水中；
13．可以再用无DNase的RNase到1mg/ml，37度保温30分钟消化RNA。
拟南芥基因组的ＰＣＲ直接鉴定法
试剂：NaOH0.5M
Tris 100mM
5-10mg叶片加入到100ul NaOH，研磨，
5ul上清加入到50ul Tris中，混匀，
取1ul做ＰＣＲ
但整个流程最好在冰上操作。
实验四植物DNA的提取[定稿]
![实验四植物DNA的提取[定稿]](https://img.taocdn.com/s3/m/5de4138468dc5022aaea998fcc22bcd126ff4203.png)
实验四植物DNA的提取[定稿]第一篇：实验四植物DNA的提取[定稿]实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。
吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。
反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。
生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。
植物DNA提取_SDS法
1植物基因组DNA的提取1）取适当新鲜叶片放入2ml离心管中，在液氮中迅速研磨成粉末。
2）加入800µl的DNA提取液和5µl的RNase A（10mg/ml）,振荡混匀。
37℃，水浴30min（水浴过程中上下颠倒混匀）。
3）加入800µl的“三混”溶液，充分混匀。
12000rpm，离心10min。
4）吸取650µl的上清液至一干净的2ml离心管，加入等体积氯仿，充分混匀。
12000rpm，离心10min。
5）吸取450µl的上清液至一干净的1.5ml离心管，加入450µl的异丙醇和45µl的3M醋酸钠（pH=5.2）,轻轻混匀，DNA析出，呈絮状沉淀。
-20℃放置30min。
6）12000rpm，离心10min。
弃上清，加入600µl的75%乙醇溶液，清洗两次。
7）弃上清液，用移液器吸尽残留酒精溶液，超净台中干燥（约5min），加入100µl的1×TE或ddH2O溶解，并置4℃中溶解过夜。
8）采用紫外分光光度计法检测DNA的含量及纯度，1%琼脂糖凝胶检测DNA的质量。
将DNA浓度统一稀释至100ng/µl，-20℃保存。
2试剂配制1）DNA提取液(1L，1%SDS，0.1M Tris，0.1M NaCl，10mM EDTA，pH=8.5)在去离子水中依次加入3.2g Na2EDTA，5.8g NaCl，12.1g Tris base，以及100ml的10%的SDS溶液，搅拌均匀后，用HCl调节pH至8.5，定容至1L。
2）“三混”溶液将Tris平衡酚、氯仿、异戊醇按体积比25：24：1，充分混匀，4℃中静置分层并避光保存。
3）3M醋酸钠(1L)称取408.24g NaAC·3H2O溶解到800ml蒸馏水中，用冰醋酸调pH至5.2，定容至l L，高压灭菌备用。
4）1×TE溶液(1L，10mM Tris，1mM EDTA，pH=8.0)在500ml水中加入1.211g Tris base，0.372g Na2EDTA，用HCl调pH至8.0，定溶至1L，高压灭菌备用。
一种植物根内生细菌DNA的提取方法[发明专利]
![一种植物根内生细菌DNA的提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a6000a8368dc5022aaea998fcc22bcd127ff427f.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810800649.X(22)申请日 2018.07.20(71)申请人 河海大学地址 211100 江苏省南京市江宁开发区佛城西路8号(72)发明人 周淇 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人 陈风平(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种植物根内生细菌DNA的提取方法(57)摘要本发明公开了一种植物根内生细菌DNA的提取方法，包含以下步骤：(1)样品前期处理：将包含植物根部组织的土柱样品冷冻干燥；(2)去除植物根系松散土壤，使得植物根表面附着的土壤厚度为1-2mm；(3)将经步骤(2)处理后的植物根放入装有PBS缓冲液的离心管中，洗涤、超声处理，获取植物根，随后低温保存；(4)将步骤(3)处理的植物根研磨、均质；(5)取步骤(4)得到的样品，提取植物根内生细菌DNA。
本发明极大减少植物根际部分细菌DNA对根内生细菌DNA的污染，分离操作行之有效，提取步骤简单易行，提取纯度高，省略了纯化步骤，安全实用，提高了植物根内生细菌DNA的提取效率和纯度。
权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 108570467 A 2018.09.25C N 108570467A1.一种植物根内生细菌DNA的提取方法：其特征在于，包含以下步骤：(1)样品前期处理：将包含植物根部组织的土柱样品冷冻干燥；(2)去除植物根系松散土壤，使得植物根表面附着的土壤厚度为1-2mm；(3)将经步骤(2)处理后的植物根放入装有PBS缓冲液的离心管中，洗涤、超声处理，获取植物根，随后低温保存；(4)将步骤(3)处理的植物根研磨、均质；(5)取步骤(4)得到的样品，提取植物根内生细菌DNA。
2.根据权利要求1所述的植物根内生细菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超声处理次数不低于10个循环。
植物DNA提取实验方案
植物DNA提取实验方案一、实验目的本实验旨在通过提取植物组织中的DNA，了解DNA的结构和功能，学习DNA提取技术。
二、实验原理DNA提取实验基于DNA的特性进行，主要包括以下几个步骤：1.组织破碎：通过物理或化学方法将植物组织破碎，使DNA暴露出来。
2.细胞溶解：使用细胞溶解液使细胞膜破裂，释放DNA。
3.蛋白质消化：加入蛋白酶等物质，将DNA周围的蛋白质降解。
4.DNA沉淀：通过加入乙醇等溶剂，使DNA沉淀。
5.洗涤和纯化：通过洗涤和纯化步骤去除杂质。
6.分析和测定：利用凝胶电泳等技术对提取得到的DNA进行分析和测定。
三、实验材料1.植物材料（如香蕉、草莓等）2.液氮或冰块3.细胞溶解液（如PBS缓冲液、CTAB溶液等）4.蛋白酶K溶液5.乙醇6.盐溶液7. DNase-free水8.1.5mL离心管9.离心机10.电磁振荡器11.热水浴12.紫外分光光度计四、实验步骤1.将所需植物材料切碎，放入离心管中。
2.将离心管放入液氮或冰块中，立即研磨材料，直至完全破碎。
3.加入适量的细胞溶解液，如PBS缓冲液，将混合物混合均匀。
4.将混合物置于电磁振荡器中，振荡5分钟。
5.加入适量的蛋白酶K溶液，混合均匀。
6.将离心管置于热水浴中，温度为55℃，孵育1小时。
7.加入相同体积的酒精，轻轻摇匀离心管，将DNA沉淀。
9.倒出上清液，加入适量的盐溶液，轻轻摇匀离心管，使DNA残留在离心管底部。
10.使用离心机将离心管离心，离心条件同上，离心10分钟。
11.倒出上清液，加入适量的乙醇，轻轻摇匀离心管，使DNA沉淀。
12.使用离心机将离心管离心，离心条件同上，离心10分钟。
13.倒出上清液，加入适量的盐溶液，轻轻摇匀离心管，使DNA残留在离心管底部。
14.使用离心机将离心管离心，离心条件同上，离心10分钟。
15. 倒出上清液，用DNase-free水洗涤DNA三次，每次离心5分钟。
16. 将离心管中的DNA溶解于适量的DNase-free水中。
真菌DNA的提取
真菌DNA的提取（方法一）1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉2.加入4mL提取液，快速振荡混匀3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）4.1000rpm，4℃，5min5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 minulTE中μ7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于5008.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，3M NaAcTE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)氯仿:异戊醇(24:1)异丙醇无水乙醇75%乙醇RNaseA真菌DNA的提取（方法二）1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 minL TE中μ6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于5007．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。
植物叶片中DNA的提取
1. 植物叶子0.1- 0.2g, 剪碎置预冷研钵中
加入1mL提取缓冲 液，研磨成浆
2. 吸入1.5mLeppendorf 管中，摇动混匀
3. 60℃水浴保温30-60min
4. 10000rpm离心5min
5. 吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀
6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；
DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图）
实验注意事项
1. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿 等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中； 2. 提取过程中的机械力可能使大分子 DNA 断 裂成小片段，所以为保证 DNA 的完整性， 各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。
思考题:1.为什么构建DNA时, 一定要用大分 子DNA？ 2. 如何检测和保证DNA的质量？
实验一
植物叶片DNA的提取
DNA extraction
实验原理
• 利用基因组 DNA 较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子 DNA 分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤 维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发 生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温 和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证 , 否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行 RFLP 和 PCR 分析 , DNA 长度可短至 50kb ，在该长度以上，可保证酶切后产生 RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段 (一般2kb以下)。 • 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离 方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立 相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酶 类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类 物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
植物基因组DNA提取技术
、
TE缓冲液、无水乙醇、70%乙醇。
实验仪器
离心机
研钵
不同型号的 eppendorf管
实验过程
实验步骤：
称取样品，液氮研磨，加入预热的(60℃ ) CTAB及β-巯基乙醇 保温1h,期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀 10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存
除多糖：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2 体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯
可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。
除酚类物质：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚 类与DNA的结合
实验过程 DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图） 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL 双链 DNA， A260/280 约为1.8
注意事项
1. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿 等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；
问题解析
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
植物生物工程实验二植物DNA的提取讲课文档
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6. 重复第3、第4步。
7. 每支离心管中加入等体积异丙醇（400－500μl）。上下颠倒 几次，4℃静置20分钟（或－20℃，15分钟）。（异丙醇用于 沉淀DNA）
8. 14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢 失。倒置离心管，空气干燥（1－2分钟）。
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测定结果分析
A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大
于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如
第十九页，共41页。
根据OD260定量：
測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：
a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml c. oligonucleotide = 33 mg/ml
1. 称取100mg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，加入液氮， 研为细粉。加入350μl新鲜2×CTAB缓冲液，再仔细研磨。 （CTAB用于抽提DNA）
2. 用350μl新鲜2×CTAB缓冲液，冲洗研磨棒，加入2μlβ－ 巯基乙醇，混匀。65℃水浴45分钟，每15分钟摇动一次。 冷却至室温，静置2分钟。
抽提液
贮存液l 168ul 4032ul
异丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB
(完整word版)植物内生菌DNA提取方法
在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。
根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。
为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。
表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。
植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。
东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。
用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。
将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。
1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。
2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。
4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6. 加入200μL 5 M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。
植物叶片DNA提取步骤
植物叶片DNA提取步骤1.样品准备：首先，选择新鲜、健康的植物叶片作为DNA提取的样品。
尽量避免使用受伤、病变或已枯萎的叶片。
同时，准备一些冰盒和冷藏离心机，以便稍后的步骤中将样品保持低温。
2.细胞破碎：将准备好的叶片样品放入液氮中快速冷冻，以阻止酶的活性和DNA降解。
随后，使用液氮马达磨碎样品，使细胞破碎并释放DNA。
也可以用杵和研钵来研磨样品。
研磨过程中可以加入一些液氮以保持低温。
3.DNA溶解：将破碎的样品转移到一个离心管中，并加入DNA溶解缓冲液。
这个缓冲液通常包含盐类、螯合剂和酶，以帮助去除细胞内的蛋白质和其他杂质。
将混合液在4°C下孵育一段时间，使DNA从细胞中溶解出来。
4.蛋白质沉淀：将溶解的样品通过离心将细胞残渣和大部分蛋白质沉淀到管底。
用一个小孔穿刺器将上清液吸走，注意不要吸入底部的沉淀物。
也可以将上清液转移到另一个清洁离心管中。
5.DNA纯化：将上清液中的DNA加入等体积的异丙醇中，轻轻混合数次，以沉淀DNA。
异丙醇可以使DNA从溶液中分离出来。
然后使用离心将DNA沉淀物沉积到离心管的底部。
将上清液去除，注意不要干扰沉积的DNA。
接下来，使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA沉淀物，以去除任何残留的盐或蛋白质。
离心去除乙醇，然后使用无菌纯水重新溶解DNA。
6.DNA的储存：将纯化好的DNA溶液转移到一个经过消毒的离心管中，并存放在低温的冰箱或冷冻柜中。
DNA的保存温度一般为-20°C或更低才能保持其稳定性。
可以在提取的DNA上进行测序、PCR或其他遗传学实验。
总结：植物叶片DNA提取步骤包括样品准备、细胞破碎、DNA溶解和纯化。
样品准备需要选择新鲜健康的叶片，而细胞破碎则使用液氮或研磨来释放DNA。
DNA溶解时需要使用缓冲液帮助溶解，而蛋白质沉淀和DNA纯化则用于去除杂质。
最后，DNA可以在低温下保存并用于后续实验。
通过这些步骤，可以从植物叶片中高效地提取到DNA，并用于分子生物学研究。
植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取DNA的方法有如下几种常见的方法：
1. CTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）：这是一种常见的DNA 提取方法，利用CTAB和其他化学试剂来分离DNA。
2. 酚/氯仿提取法：通过酚和氯仿来提取DNA，可以有效地分离植物细胞中的DNA。
3. 细胞壁酶法：使用细胞壁酶来降解细胞壁，然后通过物理方法和化学方法提取DNA。
4. 硅胶柱法（Silica column法）：使用硅胶柱来吸附DNA，然后通过洗涤和洗脱的处理，得到纯净的DNA。
5. 盐法：通过高盐浓度和乙醇等试剂来沉淀DNA，然后经过洗涤和离心分离。
6. 磁珠法：使用具有磁性的珠子来吸附和纯化DNA，具有操作简便和高纯化度的优点。
除了以上提到的方法，还有一些其他的DNA提取方法，如酶解法、离心分离法等。
每种方法都有其特定的优缺点，适用于不同的样本和实验需求。
对于特定的
植物种类和实验目的，可根据需要选择最合适的DNA提取方法。
植物DNA的提取的几种有效方法
植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。
3 取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯仿/异戊醇。
充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。
1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。
6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。
待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。
植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。
2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次),使提取液与样品充分混合。
3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,剧烈振荡,冰浴保温20ｍｉｎ以上。
4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ,将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中,(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证ＤＮＡ纯度)。
5 加入4ｍｌ氯仿/异戊醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×ｇ离心15ｍｉｎ。
6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙醇,将上清液用移液枪转入此管,在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。
真菌dna提取步骤
真菌dna提取步骤
真菌DNA提取是一项重要的实验技术，它可以用于研究真菌的遗传学特性，如基因组结构、功能基因的表达和调控等。
下面将介绍真菌DNA提取的步骤。
步骤一：样品准备
首先需要准备真菌样品，可以是培养物或者从自然环境中采集的真菌菌丝。
如果是培养物，需要在生长期内收集菌丝，如果是野生真菌，需要在采集后尽快处理样品。
步骤二：细胞破碎
将真菌样品放入离心管中，加入适量的研磨珠和研磨缓冲液，使用高速震荡器或者研磨器将样品破碎。
破碎后离心管中的混合物应该是均匀的悬浮液。
步骤三：细胞裂解
将破碎后的真菌悬浮液转移到离心管中，加入适量的裂解缓冲液和蛋白酶K，混合均匀后在60℃水浴中孵育30分钟。
这一步可以使真菌细胞壁和细胞膜破裂，释放DNA。
步骤四：DNA纯化
将裂解后的真菌悬浮液转移到离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，混合均匀后离心分离。
上层的DNA溶液可以通过吸管转移到新的离心管中，加
入等体积的异丙醇混合液，混合均匀后离心分离。
上层的DNA沉淀可以用70%乙醇洗涤，最后用去离子水溶解DNA。
步骤五：DNA浓度和质量检测
使用分光光度计或者凝胶电泳等方法检测提取的DNA浓度和质量。
DNA的浓度应该在50-100 ng/μL之间，质量应该高，没有明显的降解或污染。
综上所述，真菌DNA提取的步骤包括样品准备、细胞破碎、细胞裂解、DNA 纯化和DNA浓度和质量检测。
这些步骤需要严格控制条件，以确保提取的DNA 质量高、纯度高、浓度适宜，从而保证后续实验的成功进行。
DNA提取方法(中文版)
提取植物DNA方法1、取植物叶片装入2ml EP管，装入钢珠。
液氮冷激后，在研磨器中研磨。
加入900 ul 65℃预热的2×CTAB（实验前加入终浓度0.2%的β-巯基乙醇），65℃，水浴20min, 上下颠倒数下/5min。
2、加入700ul氯仿：异戊醇（24:1）,上下颠倒1min,静置5min。
10000rpm，5min。
3、移上清500ml至1.5ml EP管，加50ul 3M NaAc，再加550ul异丙醇，上下颠倒摇匀。
10000rpm,10min,弃上清（白色沉淀即为DNA）4、加500ul 70%乙醇，12000rpm,5min。
弃上清，干燥，加TE(200ul)。
提取植物DNA方法5 将母液DNA浓度稀释至20 ng/µl用于PCR反应的工作液(一般稀释10倍)。
OD260/OD280比值在1.7--1.9之间说明所得的DNA 纯度较好。
比值若低于1.7可能有蛋白污染，若高于2.0则DNA 很可能已降解。
EXTRACTION BUFFER (100 ml) ⨯10(1L)10%PEG 8000 10ml 1g 10g 5g1M Tris-HCl, pH7.0 10ml 10ml 100ml 50ml5M NaCl 28ml 8.19g 81.9g 40.95 5% CTAB 40ml 2g 20g 10g500mM EDTA, pH8.0 4ml 4ml 40ml 20ml 10% SLS(sodium lauryl sarcosine) 3ml 0.3g 3g 1.5gdH2O 5ml 50ml 补足1L 补足500ml灭菌备用1⨯TE（500ml）1M Tris-HCl, pH7.0 5ml500mM EDTA, pH8.0 1mldH2O 补足500ml3M NaAc 100mlNaAc 24.6g 水定容100ml。
植物DNA提取
7，倒掉乙醇，用枪头挑絮状DNA到管壁，将管底残余液取出
8，将管倒立于滤纸上烘干3min
9，加50-100μl无菌ddH2O溶解DNA.
试剂：
（1）DNA提取液：100 mmol/L Tris-HCl (Tris饱和酚）(pH 8.0) 15.764g
操ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ步骤
1，取银杏叶片0.5g-1.5g,加入3ml提取液（65°预热60min)研磨。研磨后转入10ml离心管；
2，取700μl至1.5ml离心管中，65°水浴30min，其间温和震荡离心管2-3次。
3，加入等体积氯仿，异戊醇（700μl），摇匀
4,10000r离心10min,分三层，取上清液
5，加800μl无水乙醇，得絮状DNA沉淀反复摇匀
(2)2100 mmol/L NaCl , 122.724g
(3)50 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸）, 14.6125g
（4）20g/L PVP , 20g/L CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）,
140 mmol/Lβ-ME (β-ME在使用前加) (65°预热60min再加入）
（2）氯仿：异戊醇(24:1),无水乙醇, 70%乙醇
(完整word版)真菌DNA提取方法
一、SDS法基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。
1、试剂(1)提取缓冲液Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）EDTA 50mmol/L （pH8.0）NaCl 500 mmol/L灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L(2)裂解液20%SDS(3)高盐溶液5mol/L KAc(4) RNaseA 10mg/ml(5) 异丙醇(6)灭菌ddH2O或TE2、仪器离心机，恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置3、实验程序（1）、离心菌体，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
（2）、向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动。
（3）、加入150μL 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。
（4）、4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。
（5）、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE 溶解DNA。
（6）、加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
（7）、C：I抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。
12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
（8）、用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。
（9）、电泳检测完整性。
二、lysed cells directly by phenol（一）、试剂：1、STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)2、TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)（二）、实验程序1、。
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在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。
根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。
为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。
表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。
植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。
东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。
用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。
将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。
1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。
2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。
4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6. 加入200μL 5 M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。
7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），彻底混匀，12000×g离心10 min。
8. 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。
9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6 vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1 h。
10. 4℃，12000×g离心10 min，弃上清。
11. 沉淀用70 %冰乙醇清洗，离心，弃上清。
12. DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。
13. DNA纯化采用TIANquick Midi Purification Kit。
微生物16S rRNA基因V5-V6-V7区域扩增引物：
799F2：GATGG CCATT ACGGC CNNNN NN
1193R：ACGCA TCCCC ACCTT CCTC
用含10 % SDS提取缓冲液(NaP缓冲液)重新悬浮细胞团块。
用直径0.11mm 的玻璃珠珠打操作50 s，以溶解细胞。
用苯酚-Tris (pH 8)溶液和氯仿/异戊醇提取，用0.6 vol的异丙醇和0.5 mol/L NaCl通过沉淀再次获得DNA。
用70 %的乙醇洗涤细胞团块，真空干燥，再溶解在50μl的超纯水中。
原始DNA提取物用Glassmilk purification kit (Bio101, La Jolla, CA)进一步纯化。
所需试剂：Na2HPO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，10 % SDS（十二烷基硫酸钠），Tris饱和酚，氯仿/异戊醇（体积比24:1混合），异丙醇，0.5 mol/L NaCl，70 %乙醇。
苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因
而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水
不相混溶，不会带走DNA。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一
份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定
Tris平衡苯酚的配制方法
1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。
但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。
同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。
因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。
所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。
3. 苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下：
①液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。
从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。
②加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％。
该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色。
有助于方便识别有机相。
③加入等体积的1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。
④重复操作步骤③。
⑤加入等体积的0.1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。
⑥重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相。
⑦使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
⑧将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存
唐琳的引物：
F357GC(5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG CCTAC GGGAG GCAGC AG-3’)
R518(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)。