抗体纯化

b.抗原柱纯化
三 纯化步骤
3.1试剂： 3.1.1couping buffer ：0.1MNaCO3 0.5MNaCl Total 1L (PH8.3) 3.1.2PBS 10 mM Na2HPO4 3.58g 1.8 mM NaH2PO4 0.28g 140 mM NaCl 8g Total 1L PH7.4 3.1.3 1mMHCl (PH 2-3) 3.1.4 封闭液： 1M Tris （PH8.0） 3.1.5 中和液： 饱和磷酸盐溶液 3.1.6 CBB 溶液 3.1.7 0.01M Tris (PH7.5) 3.1.8 洗脱液：PH2.5 HCl + 150Mm NaCl
3.2 步骤 3.2.1抗原透析 （仅用于融合蛋白）
3.2.1.1 准备好透析夹,并在上面贴上标签
3.2.1.2 剪取适当长的透析袋（1cm透析袋约可容纳3ml 的溶液）, PBS洗三次3次 3.2.1.3 透析夹夹好透析膜的一端,加入抗原,夹好另一端
3.2.1.4 配制新鲜的透析液,并将透析膜置于其中, 4℃ 6小 时或者过夜,重复三次;(注意:透析中应经常观察,一是防止 透析袋中的蛋白发生沉淀,二是防止透析夹上的标签脱落)
配体的选择
1.配体要与纯化的物质有较强的亲和力 2.配体要具有与基质共价结合的基团 根据所选的配体不同，我们用免疫亲和 层析法纯化抗体的方法可分为： a.蛋白A或蛋白G柱纯化 蛋白A或蛋白G是细胞壁蛋白，它们能结 合抗体Fc段.这一结合非常牢固，但亲和力 对PH 的变化敏感，抗体/蛋白A或蛋白G的 亲和力随PH值的降低而急剧降低。由于它 们对不同类型抗体的结合能力存在差异， 对它们的选择如下图
3.2.2连接 3.2.2.1 准备好 1mMol/L HCl，并放入4℃预冷 3.2.2.2 计算所需的CNBr-activated Sepharose4B的量 （1 克冻干的粉末可以活化成3.5ml的beads，1mlbeads吸附510mg蛋白）； 3.2.2.3 将称量好的beads放入预冷的HCl中活化，在4℃放 置15min 3.2.2.4 剪好滤纸，装好抽滤装置，先用预冷的HCl冲洗抽滤 装置 3.2.2.5 将beads加入抽滤装置中，1mlbeads用200ml HCl 抽滤
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基质的选择
理想的基质应满足下面的要求： 1.极低的非特异性吸附性 2.高度的亲水性。亲和吸附剂要易与水溶液 中的生命大分子物资接近； 3. 较好的理化稳定性。当配体固化和各种 因素（如PH、离子强度、温度和变性剂等） 变化时，基质很少甚至不受影响；
4.大量的化学基团能被有效地活化，而且容 易和配体结合； 5.适当的多孔性。具体要求须根据分离物的 性质而定。 一般的亲和吸附剂采用的基质有纤维素、 聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、 胶联琼脂糖以及多孔玻璃珠。目前用的最 多的是琼脂糖珠。
3.2.2.6 将抽滤后beads放在一干净的PE 手套上，与透析好 的抗原一起转移到15ml离心管中，封口膜封口，孵育， 室温2小时或4℃过夜 3.2.2.7 将结合了抗原的beads转移到纯化管中，加入 couping Buffer15ml冲洗 3.2.2.8 加入封闭液3ml，孵育，室温2小时或4℃过夜 3.2.2.9 PBS冲洗3次
离子交换层析原理
利用蛋白质的酸碱性质，使蛋白质混合 物与离子交换纤维素的酸性基或碱性基相结 合。由于盐类的存在可以降低离子交换剂的 离子基团和蛋白质的相反电荷基团之间的静 电相互吸引，通过改变溶液中盐类离子强度 和PH可以将蛋白质分离。层析血清IgG的常 用纤维素为DEAE-32。
免疫亲合层析原理
3.2.3 纯化
3.2.3.1 将连接抗原的beads和血清一起孵育，室温 2小时或4℃过夜 3.2.3.2 让血清流出纯化管，收集
3.2.3.3 用10ml PBS冲洗beads
3.2.3.4 在EP管中事先加入50ul中和液 3.2.3.5 加入洗脱液，每次1ml，分管收集
3.2.3.6 同时用CBB溶液检测收集的抗体浓度， 100ulCBB溶液加入3.3ul收集液
3.2.3.7 将浓度高的收集液集中，于4℃暂时保存
3.2.3.8 加入0.01M Tris (PH7.5)15ml 3.2.3.9 加入15ml PBS冲洗
3.2.3.10 加入2ml含0.02%叠氮钠的PBS储存beads， 4℃
3.3 抗体长期保存条件: 50% 甘油+0.1%叠氮钠
抗体的纯化
一 纯化目的
从血清中提取特异性结合的抗 体
二 纯化原理
常用盐析法、凝胶柱层析、离子交 换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血 清抗体进行分离纯化。
盐析法原理
水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳 定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的 （ NH4 ） 2SO4 或 Na2SO4 盐类，使溶液中大部分自由 水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基 团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白 质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携 带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级 析出。 33% （ NH4 ） 2SO4 为沉淀 IgG 的最适饱和度。
把具有识别能力的配体L以共价键的方 式固化到含有活化基团的基质M上，制成 亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固 化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。 因此，当把固相载体装入小层析柱后，让 欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对 配体有亲和力的物质S就可以借助静电引
力、范德华力，以及结构互补效应等作用 吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异 性吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来； 然后恰当的改变起始缓冲液的PH值或增强 离子强度或加入抑制剂等因子，即可以把 物质S从固相载体上解离下来，通过这一操 作程序就可以把有效成分与杂质分离开来。