枯草芽孢杆菌培养基的优化分析研究

目录
枯草芽孢杆菌培养基的优化研究- 2 -
1 枯草芽孢杆菌简介及应用- 3 -
1.1 枯草芽孢杆菌简介- 3 -
1.2 枯草芽孢杆菌应用- 3 -
2材料和方法- 4 -
2.1 实验材料- 4 -
2.1.1 菌株- 4 -
2.1.2 培养基- 5 -
2.1.3 仪器与设备- 5 -
2.2 培养基的优化- 5 -
2.2.1 培养方法- 5 -
2.2.2 检测方法- 5 -
2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -
2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -
3 结果和分析- 7 -
3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -
3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -
3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -
3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -
3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -
3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -
参考文献- 10 -
枯草芽孢杆菌培养基的优化研究
摘要。

随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到
重视。

而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，对
枯草芽孢杆菌的研究也越来越多，对枯草芽孢杆菌的需要也越来越大。

为
了在枯草芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高枯草芽孢杆菌
的产量，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行研究。

本文先就培养基的主要原料，含水量，碳源，氮源，碳氮比，pH等几个因
素作单因素实验。

研究表明最佳培养基是：稻草49.05%，玉M粉2.25%，
尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0% ，水含量57%，pH 7.8[1][2]。

关键词。

枯草芽孢杆菌。

培养基优化[3]。

应用
Bacillus subtilis culture medium optimization
Abstract :along with the country the support to agriculture, microbial
fertilizer has application in agriculture has been paid more and more
attention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of a
wide range of applications, therefore, on Bacillus subtilis are studied
more and more, on Bacillus subtilis needs more and more. In order to
Bacillus subtilis in industrial production, reduce production cost and
can improve the yield of Bacillus, Bacillus subtilis fermentation
medium of.
This article first medium main raw material, water content, carbon
source, nitrogen source, carbon and nitrogen ratio, pH and several other
factors single factor experiment. Research shows that the optimum
medium was49.05%: straw, corn flour 2.25% ,urea 0.9%,CaCO 31.8%,
KH3 PO 4 1%, water content 57%, pH 7.8[1] [2].
Key words:Bacillus subtilis。

medium optimization。

application
1 枯草芽孢杆菌简介及应用
1.1 枯草芽孢杆菌简介
枯草芽孢杆菌<Bacillaceae）编号为Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞0.7～0.8×2～3微M，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微M，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液
体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。

可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。

早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae> 的模式菌株[2]，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。

1.2 枯草芽孢杆菌应用[4]
枯草杆菌(B acillus Subtilis> 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。

同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。

随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。

①枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用[5]
工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。

枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。

由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

②枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用[5]-[7]
枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA> 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。

我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。

③枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好实验材料[5]
枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。

④枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用[5]
枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。

枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合
物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。

另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。

⑤枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用[5]
研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。

⑥枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用[5]
枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体(氨、硫化氢等> ，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等> ，后分解为更小分子的有机物，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD ，使水
体中氨基氮(NH
3-N> 、亚硝基氮(NO
2
-N> 和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，
同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。

浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。

越来越多研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用。

2材料和方法[6]～[19]
2.1 实验材料
2.1.1 菌株
枯草芽孢杆菌
2.1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨液体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，20g琼脂, 1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5。

1号培养基：3g木屑, 0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。

2号培养基：3g稻草, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL 水。

3号培养基：3g玉M芯, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。

4号培养基：3g糠壳, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2gCaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL 水。

2.1.3 仪器与设备
高压灭菌锅、超净工作台、37℃摇床培养箱、培养箱、光学显微镜、电烘箱、电子天平、分析天平、冰箱、三角瓶、接种环、试管、培养皿、酒精灯
2.2 培养基的优化
2.2.1 培养方法
先用接种环接种1环试管菌种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，200r/min，37℃培养24h，进行扩大培养和活化，然后再取1mL液体种接种到发酵培养基中，37℃培养48h。

2.2.2 检测方法
活菌的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min 摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到一个适当的稀释度，取0.1mL稀释液到无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基中并涂匀，37℃培养24h，然后数培养皿上的菌落数[7]。

芽孢率的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到10，取0.02mL滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。

2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响
麦麸与稻草的比例确定以后，即可得其含水量为67%，分别以75%，71%，63%，59%，55%代替其含水量作为发酵培养基，在其它成分和条件不变的情况下培养48h，检测各处理后的活菌数和芽孢率，计算得其单位质量的干重的发酵培养基的芽孢数，以确定最佳的含水量。

2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响
分别以稻草粗细程度为<0.5mm,0.5～1.0mm,1.0～1.5mm,>1.5mm,混合样作为发酵培养基，其它组分不变，相同发酵条件下培养48h,检测各的活菌数和芽孢率，以确定稻草的最佳粗细程度。

2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响
在相等的N含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母膏，豆饼粉，尿素，<NH）SO及不同组合作为N源，其它成分不变，相同条件下培养48h,检测活菌数和芽孢率，以确定最佳N源。

2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响
确定N源后，在保持C含量不变的情况下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉M粉，玉M淀粉，大M粉作为C源制作发酵培养基，其它组分不变，相同条件下培养48h，测定活菌数和芽孢率，确定最佳C源。

2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响
确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1,1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1,1:0的C/N比(原料质量比>配制发酵培养基，其它成分不变，在相同的条件下培养
48h，
检测发酵料中和活菌数和芽孢率，以确定最佳的C/N比。

2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响
改变发酵培养基中的pH值，分别以pH值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5作为发酵培
养基，其它成分不变，在相同的发酵条件下培养48h，检测活菌数和芽孢率，得最佳pH。

3 结果和分析
3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响
表1 含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响
含水量活菌数<10）芽孢率<%）单位质量培养基的活
菌数<10）75% 4.5 47.2 1.8
71% 3.4 65.5 1.2
67% 10 91.1 3.0
63% 7.6 67.6 2.1
59% 16 90.9 3.9
55% 12 49.2 2.7 通过对比观察，含水量对枯草芽孢杆菌的芽孢率影响比较大，而对单位质量发酵后的培养基中所含的活菌数影响不是很大。

从上表中的活菌数和芽孢率两方面综合分析，含水量为59%时对枯草芽孢杆菌生长有利。

3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响
表2 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响
稻草粗细程度活菌数<10）芽孢率<%）
<0.5mm 15 88.5
0.5～1.0mm 9.9 87.6
1.0～1.5mm 14 87.6
>1.5mm 9.7 89.9
混合样11 90.8 通过对比观察，可以得出稻草粗细程度对培养基的活菌数和芽孢率的影响不是很明显，基本都处于一个数极的。

但是在工业化生产中，粉碎稻草并区分不同的粗细程度，需要一定的人力物力，从而提高了工厂的生产成本，不利于工业化生产，所以一般选择稻草的粗细程度为混合样，可以大大降低生产成本，而发酵培养基的活菌数和芽孢率又不低，有利于大规模化的工业生产。

3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响
表3 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响
培养基活菌数芽孢率
一 1.2×1090.6%
二 5.8×1090.2%
三 1.2×1089.6%
四7.4×1088.4%
五 1.0×1033.5%
六 1.1×1091.2%
七8.9×1068.8% 通过对比观察，可以发现<NH）SO不利于培养基产芽孢，发酵48h后的培养基的芽孢率都比较低；而蛋白胨和酵母膏对培养基的活菌数和芽孢率影响相差不大，其中用尿素作为氮源时，培养基的活菌数和芽孢率都很高，而且尿素的价格较其它几种氮源都要低，可以降低生产成本，有利于工业化的生产。

3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响
表4 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响
碳源活菌数<109）芽孢率<%）
葡萄糖12 90.7
蔗糖11 89.8
玉M粉24 92.3
玉M淀粉 4.9 60.5
大M粉37 37.6 通过对比观察，可以得出葡萄糖和蔗糖对培养基中的活菌数和芽孢率的影响差不多，而大M粉有利于枯草芽孢杆菌的生长，但产生芽孢少，发酵后培养基的芽孢率低。

综合考虑发酵后培养基中的活菌数和芽孢率，可以明显地得出玉M粉作为碳源时对枯草孢芽杆菌的生长和产芽孢都有利，适合于大规模化的工业化生产。

3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响
表5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响
碳氮比活菌数<10）芽孢率(%>
0:1 0.000004 20.1
1:3 1.7 91.2
1:2 2.4 90.8
1:1 3.0 92.7
2:1 4.1 93.5
3:1 2.8 91.7
4:1 2.5 92.1
5:1 2.2 92.6
7:1 1.5 93.1
1:0 0.000003 19.2
通过对比观察，可以发现当发酵培养基中只有碳源和氮源中的一种时，发酵后检测出的活菌数和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生产；而如果培养基中碳源和氮源都有时，可以看出发酵后培养基的芽孢率相差不大。

而对于大规模化的工业生产，需要的是活菌数和芽孢率都高的生产配方，当碳氮比为2:1可以满足生产需求。

3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响
表6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响
pH 活菌数(109> 芽孢率(%>
5.5 1.2 87.5
6.0 8.8 90.4
6.5 18 91.3
7.0 32 92.8
7.5 53 94.5
8.0 21 94.9
8.5 8.9 95.2
通过对比观察，可以发现pH值对培养基的芽孢率影响不大，基本上都在90%左右，pH值主要是影响培养基的活菌数。

综合表中的活菌数和芽孢率两项指标，得出pH值为7.5时培养基的活菌数和芽孢率都很高，符合规模化的工业生产。

4 讨论
本课题以农作物的副产品为培养基的基础物料，在前人研究的基础上，采用单因素实验和正交实验相结合的方法，对枯草芽孢杆菌的固体发酵培养基进行研究。

研究表明枯草芽孢杆菌的最佳发酵培养基为麦麸45%，稻草49.05%，玉M粉2.25%，尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0%，水含量57%，pH 7.8.
枯草芽孢杆菌的应用非常广泛，在工业和农业上都有非常好的发展前景，对枯草芽孢杆菌培养基的研究也有很大的空间。

参考文献
[1]刘惠知，孔利华，周映华，黄建军. 益生菌枯草芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化[M]. 科技动态.
[2]孙笑非，孙鸣. 一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化[M]. 爱保生论坛.
[3]郭小华，陆文清，邓萍，黄德仕. 益生枯草芽孢杆菌 MA139 增殖培养基的优化
[M]. 中国农业大学学报.2006 ,11 (3> : 41-46.
[4] 惠明，窦丽娜，田青，侯银臣枯草芽孢杆菌的应用研究进展安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci. 2008 ，36 (27> :11623 - 11624 ，11627
[5]惠明，窦丽娜，田青，侯银. 枯草芽孢杆菌的应用研究进展[M]. 安徽农业科学.Journal of Anhui Agri．Sci．2008. 36(27>：11623一11624，11627.
[6]张志焱, 徐海燕, 杨军方. 枯草芽孢杆菌固体发酵培养基的优化[M]. 工艺与设备.
[7]吴玲, 何颖. 瑞士乳杆菌增菌培养基的筛选[J]. 常州工程职业技术学院学报, Vol. 4 2007 December No.54.
[8]田晓丽，赵红杰，唐彩乐. 生防放线菌153固态发酵条件的优化及其耐热力检测[J]. 西北农林科技大学学报<自然科学版）, Vol.38No.7 Ju.1.2018..
[9] 朱强, 夏艳秋, 董克克. 响应面法优化灵芝药性固体发酵培养基[J]. 中国生物工程杂志, 2018，30( 9> : 75-79.
[10]TIMMONSM B, LOSORDO TM. Aquaculture water reuse systems. Engineering design and management [M]. 2nd edition.Amsterdam. Elsevier, 1997.
[11]Panagiot ou G, Olavarria R, Olss on L. Penicillium brasilianum as anenzyme factory。

the essential role of feruloyl esterases for the hydr olysis of the plant cell wall . JB iotech, 2007, 130 (3> : 219～228. [12]许俊杰,钟文文. LY424细菌菌株产红色素条件的优化[J]. 山东农业大学学报(自然科学版> , 2018, 41 (1> : 39 – 44.
[13]冯宇，高年发，张颖. 短乳杆菌生产γ-氨基丁酸培养基的优化[J]. 现代食品科技, 2018, Vol.26, No.1.
[14]张蕾, 石新丽, 李敏. 短小芽孢杆菌TY079 产抗菌物质的发酵培养基研究[N]. 河北省科学院学报, Vol. 27 No. 2 Jun. 2018.
[15]丁翠珍, 裘季燕, 刘伟成. 枯草芽孢杆菌B02 产生拮抗物质培养基及发酵条件优化[J]. 中国生物防治, 2008 年5 月.
[17] 张蕾，张铎，张丽萍等. 枯草芽孢杆菌BSD-2 产抗菌肽发酵培养基的优化[J]. 食品科学,2018, Vol. 31, No. 03 189.
[18]Xu J, Chen S W, Yu ZN. Optimization of process parameters for polyγ-glutamate pr oducti on under solid state fer mentati on from Bacillus subtilis CCTCC202048. Pro B iochem , 2005, (40> : 3075～3081
[19]RAMKR IS HNA S , S WAMI NMHAN T. Respon sesurfacemodeling and optimi zation to eluci date and analyztheeffects of inoc u lu ms age and size on surfact i n production [ J]. Biochem ical Engineering Journ a, l 2004, 21: 1412148.
青海师范大学生命与地理学学院。