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CellEngin7
（七）抗体检测
免疫荧光试验 放射免疫试验(RIA) 联免疫吸附试验(ELISA)
CellEngin7
ELISA用于破伤风抗体的筛选
ELISA
（八）单克隆抗体的大量制备
体内法 培养法
动物体内诱生法
• 优缺点 1. 比较经济， 2. 产物量多效价高， 3. 还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交
再用ELISA或免疫亲和层析法筛选出特异性抗 体。
Filamentous phage
The M13 filamentous phage
pV
pVI
pVII
pIII
pVIII
• 虽有多种外壳蛋白被试用于噬菌体展示，目前主 要应用的是基因Ⅷ蛋白和基因Ⅲ蛋白。
基因Ⅷ蛋白：外壳主要蛋白，2700个拷贝，成 熟蛋白分子只有50个氨基酸残基，其中央有一段 疏水区，当噬菌体在大肠杆菌细胞内增殖时，所 产生的基因Ⅷ蛋白通过这段疏水区嵌镶在细菌内 膜上，当释放时，包被在噬菌体DNA外面。将外 源蛋白的基因与基因Ⅷ融合，就会在噬菌体表面 表达出多个拷贝的外源蛋白。多价表达有利于对 低亲和力配体或受体的筛选。
改型抗体技术
鼠源性基因 人源性基因
噬菌体抗体库技术
将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录 成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；
然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克 隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋 白Ⅲ基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染 大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会 释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；
将外源基因与基因Ⅲ融合，在噬菌 体表面仅表达少量外源性蛋白，有利于 高亲和力配体或受体的筛选。
Phage display of peptides
pV
pVI
pVII
pIII
pVIII foreign peptide
M13 display
p III
p VIII
- 3 - 5 copies/virion
- 2700 copies/virion
- monovalent display - multivalent display
- large proteins
- small peptides
- N-terminal display
- N-terminal display
人源性单抗的制备方法
EBV转化技术 EBV转化---融合技术 嵌合抗体技术 改型抗体技术 噬菌体抗体库技术
பைடு நூலகம்
EBV
EBV转化技术
EBV转化---融合技术
嵌合抗体技术
人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一 部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留 对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结 合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。
基因Ⅲ蛋白：分子量是 42000，含有 406 个氨基酸残基，在病毒感染的细菌内， 以其靠近羧基端的23个氨基酸组成的穿 膜区固定于内膜上，氨基端朝向周质腔。
位于噬菌体颗粒的一端，有3-5个拷 贝，其氨基端第1-198位氨基酸能够与大 肠杆菌的性菌毛结合，介导噬菌体颗粒 对大肠杆菌的感染，其羧基端部分则与 子代噬菌体从细菌胞内释放过程有关。
四、单克隆抗体的应用
单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。
利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。
单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。
单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。
单克隆抗体靶向制剂
利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作 用的制剂。
第五节 人源单克隆抗体
主要困难
（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合 率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获 得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹 腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱 生腹水是很困难的。
瘤细胞株， 4. 缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，纯化难。
要点： 选用BALB／c小鼠（ 因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB／c小鼠）
破坏小鼠腹腔内膜（注入细胞的几周前，预先将具有刺激性的有机溶剂 降植烷(pristane)注入腹腔内，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境使杂交 瘤细胞在腹腔内增殖良好）
用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc 区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫 反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究 人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换 鼠源性的Fc段DNA。
Ig分子的基因结构
嵌合抗体技术
• 嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区 • 人鼠源性抗体高变区人抗体
改型抗体技术
注射1xl06杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清 液冻存。一般在接种杂交瘤细胞后7---12d便能抽取到腹水，抽取几次， 即可达10ml。
• 体外培养法
• 培养基： 多采用RPMll640培养液，添加10％～20％胎牛或小牛血清。
• 特点：
由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100mg／m1以上，给 纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间 质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞生长。所以，近年来发展起来的 无血清培养法，就是利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合 物来代替小牛血清。虽然该法可减少污染又有利于单克隆抗体的纯化， 但产量不高。
嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而 仍有一定的免疫原性。
为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性， Winter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互 补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。
由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自 小鼠，因而称为CDR移植抗体（CDR grafted antibody） 。这种抗体在人体内免疫性大为降低
（七）抗体检测
免疫荧光试验 放射免疫试验(RIA) 联免疫吸附试验(ELISA)
CellEngin7
ELISA用于破伤风抗体的筛选
ELISA
（八）单克隆抗体的大量制备
体内法 培养法
动物体内诱生法
• 优缺点 1. 比较经济， 2. 产物量多效价高， 3. 还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交
再用ELISA或免疫亲和层析法筛选出特异性抗 体。
Filamentous phage
The M13 filamentous phage
pV
pVI
pVII
pIII
pVIII
• 虽有多种外壳蛋白被试用于噬菌体展示，目前主 要应用的是基因Ⅷ蛋白和基因Ⅲ蛋白。
基因Ⅷ蛋白：外壳主要蛋白，2700个拷贝，成 熟蛋白分子只有50个氨基酸残基，其中央有一段 疏水区，当噬菌体在大肠杆菌细胞内增殖时，所 产生的基因Ⅷ蛋白通过这段疏水区嵌镶在细菌内 膜上，当释放时，包被在噬菌体DNA外面。将外 源蛋白的基因与基因Ⅷ融合，就会在噬菌体表面 表达出多个拷贝的外源蛋白。多价表达有利于对 低亲和力配体或受体的筛选。
改型抗体技术
鼠源性基因 人源性基因
噬菌体抗体库技术
将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录 成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；
然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克 隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋 白Ⅲ基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染 大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会 释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；
将外源基因与基因Ⅲ融合，在噬菌 体表面仅表达少量外源性蛋白，有利于 高亲和力配体或受体的筛选。
Phage display of peptides
pV
pVI
pVII
pIII
pVIII foreign peptide
M13 display
p III
p VIII
- 3 - 5 copies/virion
- 2700 copies/virion
- monovalent display - multivalent display
- large proteins
- small peptides
- N-terminal display
- N-terminal display
人源性单抗的制备方法
EBV转化技术 EBV转化---融合技术 嵌合抗体技术 改型抗体技术 噬菌体抗体库技术
பைடு நூலகம்
EBV
EBV转化技术
EBV转化---融合技术
嵌合抗体技术
人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一 部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留 对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结 合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。
基因Ⅲ蛋白：分子量是 42000，含有 406 个氨基酸残基，在病毒感染的细菌内， 以其靠近羧基端的23个氨基酸组成的穿 膜区固定于内膜上，氨基端朝向周质腔。
位于噬菌体颗粒的一端，有3-5个拷 贝，其氨基端第1-198位氨基酸能够与大 肠杆菌的性菌毛结合，介导噬菌体颗粒 对大肠杆菌的感染，其羧基端部分则与 子代噬菌体从细菌胞内释放过程有关。
四、单克隆抗体的应用
单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。
利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。
单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。
单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。
单克隆抗体靶向制剂
利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作 用的制剂。
第五节 人源单克隆抗体
主要困难
（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合 率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获 得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹 腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱 生腹水是很困难的。
瘤细胞株， 4. 缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，纯化难。
要点： 选用BALB／c小鼠（ 因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB／c小鼠）
破坏小鼠腹腔内膜（注入细胞的几周前，预先将具有刺激性的有机溶剂 降植烷(pristane)注入腹腔内，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境使杂交 瘤细胞在腹腔内增殖良好）
用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc 区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫 反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究 人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换 鼠源性的Fc段DNA。
Ig分子的基因结构
嵌合抗体技术
• 嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区 • 人鼠源性抗体高变区人抗体
改型抗体技术
注射1xl06杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清 液冻存。一般在接种杂交瘤细胞后7---12d便能抽取到腹水，抽取几次， 即可达10ml。
• 体外培养法
• 培养基： 多采用RPMll640培养液，添加10％～20％胎牛或小牛血清。
• 特点：
由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100mg／m1以上，给 纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间 质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞生长。所以，近年来发展起来的 无血清培养法，就是利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合 物来代替小牛血清。虽然该法可减少污染又有利于单克隆抗体的纯化， 但产量不高。
嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而 仍有一定的免疫原性。
为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性， Winter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互 补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。
由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自 小鼠，因而称为CDR移植抗体（CDR grafted antibody） 。这种抗体在人体内免疫性大为降低