发酵工业无菌技术PPT课件
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发酵工业无菌技术 ppt课件
四者的区别 在发酵工业中的应用
5
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
染菌的不良后果 染菌危害的具体分析
染菌的检查与判断 污染原因分析 预防
6
染菌的不良后果
• 消耗营养 • 合成其他产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 • 改变pH • 分解产物 • 噬菌体破坏极大
7
染菌危害的具体分析
• 培养基与设备灭菌不彻底的防治
– 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 – 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 – 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加
消泡剂防止泡沫升顶 – 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 – 灭菌后期罐压骤变 – 死角
18
发酵罐的“死角”
➢法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、 联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 ➢口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 ➢发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
➢ 发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
➢ 发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点 和具体情况来决定
➢ 发酵后期污染
➢ 染菌量不太多，可继续发酵
➢ 污染严重，则提前放罐
11
具体情况
柠檬酸发酵
污染细菌
加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌
污染酵母
23
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较 （五）灭菌技术参数
24
（一）湿热灭菌原理
灭菌温度和时间的选择 影响培养基灭菌的其它因素
25
5
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
染菌的不良后果 染菌危害的具体分析
染菌的检查与判断 污染原因分析 预防
6
染菌的不良后果
• 消耗营养 • 合成其他产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 • 改变pH • 分解产物 • 噬菌体破坏极大
7
染菌危害的具体分析
• 培养基与设备灭菌不彻底的防治
– 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 – 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 – 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加
消泡剂防止泡沫升顶 – 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 – 灭菌后期罐压骤变 – 死角
18
发酵罐的“死角”
➢法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、 联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 ➢口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 ➢发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
➢ 发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
➢ 发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点 和具体情况来决定
➢ 发酵后期污染
➢ 染菌量不太多，可继续发酵
➢ 污染严重，则提前放罐
11
具体情况
柠檬酸发酵
污染细菌
加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌
污染酵母
23
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较 （五）灭菌技术参数
24
（一）湿热灭菌原理
灭菌温度和时间的选择 影响培养基灭菌的其它因素
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发酵工业无菌技术应用护理课件
发酵工业无菌技术应用护 理课件
目 录
• 发酵工业无菌技术概述 • 无菌技术的基本原理 • 发酵工业无菌技术应用实例 • 无菌技术的质量控制和安全管
• 无菌技术的未来发展和趋势
01 发酵工业无菌技术概述
无菌技术的定义和重要性
定义
无菌技术是指在发酵工业中，通过一系列操作和控制措施， 消除或降低微生物、杂质和污染物的存在，以确保产品的质 量和安全。
应急处置
建立完善的应急处置体系，制定应急预案，配备应急设备和人员，确 保在突发事件发生时能够迅速、有效地应对。
应对突发事件的预案和演练
预案制定
根据发酵工业的特点和实际情况，制 定针对性的突发事件应对预案，明确 应对措施和责任人。
演练实施
定期组织员工进行应急演练，提高员 工应对突发事件的能力和自救互救技 能。
利用大数据和人工智能技术，对生产 过程中的数据进行分析和优化，发现 潜在问题和改进点，提高生产效率和 产品质量。
自动化生产线
通过机器人技术和自动化设备，实现 无菌生产线的自动化和智能化，减少 人工干预和误差，提高生产效率和安 全性。
无菌技术的可持续发展和环保要求
环保材料的使用
01
优先选择可降解、环保的原材料和包装材料，减少对环境的污
质量检验
对发酵工业产品进行严格的质 量检验，包括理化指标、微生 物指标等，确保产品质量合格。
安全管理的原则和措施
预防为主
将预防作为安全管理的核心，通过科学的风险评估和隐患排查，降低 事故发生的风险。
强化培训
定期对发酵工业从业人员进行安全培训和教育，提高员工的安全意识 和操作技能。
规范操作
制定严格的发酵工业操作规程和安全管理制度，确保员工按照规程进 行操作。
目 录
• 发酵工业无菌技术概述 • 无菌技术的基本原理 • 发酵工业无菌技术应用实例 • 无菌技术的质量控制和安全管
• 无菌技术的未来发展和趋势
01 发酵工业无菌技术概述
无菌技术的定义和重要性
定义
无菌技术是指在发酵工业中，通过一系列操作和控制措施， 消除或降低微生物、杂质和污染物的存在，以确保产品的质 量和安全。
应急处置
建立完善的应急处置体系，制定应急预案，配备应急设备和人员，确 保在突发事件发生时能够迅速、有效地应对。
应对突发事件的预案和演练
预案制定
根据发酵工业的特点和实际情况，制 定针对性的突发事件应对预案，明确 应对措施和责任人。
演练实施
定期组织员工进行应急演练，提高员 工应对突发事件的能力和自救互救技 能。
利用大数据和人工智能技术，对生产 过程中的数据进行分析和优化，发现 潜在问题和改进点，提高生产效率和 产品质量。
自动化生产线
通过机器人技术和自动化设备，实现 无菌生产线的自动化和智能化，减少 人工干预和误差，提高生产效率和安 全性。
无菌技术的可持续发展和环保要求
环保材料的使用
01
优先选择可降解、环保的原材料和包装材料，减少对环境的污
质量检验
对发酵工业产品进行严格的质 量检验，包括理化指标、微生 物指标等，确保产品质量合格。
安全管理的原则和措施
预防为主
将预防作为安全管理的核心，通过科学的风险评估和隐患排查，降低 事故发生的风险。
强化培训
定期对发酵工业从业人员进行安全培训和教育，提高员工的安全意识 和操作技能。
规范操作
制定严格的发酵工业操作规程和安全管理制度，确保员工按照规程进 行操作。
第四章发酵工业的无菌技术
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
1.2发酵工程的无菌技术第1课时课件高二下学期生物选择性必修3
种类
湿热灭 菌法
过滤除 菌法
概念
利用__饱__和__蒸__汽__进 行灭菌的方法
通过__过__滤__阻留微 生物从而达到除菌 目的的方法
续表
应用或注意事项 .在温度为__1_2__1 、气压约____1_0的0 条件下维持 ； .蒸汽穿透力____，蒸汽与较大低温的物 体表面接触凝结为水时可放出__大__量__能量，吸收了蒸 汽水分和热量的菌体蛋白质易__变__性__； .在相同温度 下湿热灭菌比干热灭菌__更__有__效__ .在工业生产上制备___无__菌__空__气_，用于好氧微生物的 发酵； .在产品提取过程中，也可以利用过滤除菌法处理料 液，以获得__无__菌__产品
二、发酵工程的灭菌设备
1. 电热鼓风干燥箱
常用于空的__玻__璃__器__皿__（如培养皿、离心管、移液管）、金属用具（如 适用对象 __镊__子__、手术刀）和其他耐__高__温__的物品（如菌种保藏采用的沙土管、石
蜡油、碳酸钙）的灭菌，但带有胶皮或塑料的物品、液体及固体培养基一 般__不__能__采用该方法干热灭菌 优点 使灭菌器皿保持__干__燥__ 不得将易腐、易燃、易爆物品放入箱内干燥灭菌；干燥箱工作时，必须将 注意事项 风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏；箱内应经常保持清洁，长 期不用应套好防尘罩，放置在干燥的室内等
续表 目的或分析说明 逐步接种。划破培养基不利 于后续的继续划线，长出的 菌落不标准
防止杂菌污染
培养酵母菌，观察接种和培 养的结果
2.接种成功的标准 若培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则 说明接种操作是符合要求的；若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌 操作还未达到要求。实验失败，需要分析原因，再次接种。
4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
二 如：
发 酵 工
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌 的危害大；
业 污
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的
染 危害较大；
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同污染时期对发酵的影响
二
发 种子培养期 菌浓低，营养丰富；灭菌；
酵 工
发酵前期 杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的
业 繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；
通；
略
发酵工业无菌技术
2.无菌空气带菌及防止；
二 3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防
发 酵
止：原料 蒸汽压力 设备死角
工 业
4.设备渗漏引起的染菌及防止；
污 染
5.操作不规范引起的染菌
的
防
治
策
略
第 发酵染菌的拯救与处理
十 一
1.种子培养期染菌的处理：灭菌，倒种；
章 2.发酵前期染菌的处理：灭菌，接种；
养 基Байду номын сангаас
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致
发酵工业无菌技术
无菌室 室内布置应尽量简单，通常用30瓦
二 发
紫外线灭菌灯照射20~30分钟，配合使用化 学灭菌药剂；无菌室内无菌度的要求是：
酵 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放
工 业
置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的
污 染
菌落在3个以下为好。
的 防
灭菌锅 灭菌操作时需要注意排气管是否畅
治 策
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
发酵工业无菌技术
一 发酵工业的无菌处理
在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存
在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因
项目四-发酵工业的无菌操作PPT课件
23
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
24
. 25
.
26
消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
57
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
20
.
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
.
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
.
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
.
常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
47
法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
48
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
49
（4）设备渗漏染菌及防止 原因
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
24
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26
消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
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溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
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CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
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2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
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常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
47
法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
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（4）设备渗漏染菌及防止 原因
发酵工程发酵工业的无菌技术课件
4.2.1 杂菌污染的危害
*
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化； 5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。
*
染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
*
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。
*
密闭式发酵罐
*
*
*
2、机械搅拌发酵罐的结构
好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等
*
*
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
*
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化； 5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。
*
染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
*
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。
*
密闭式发酵罐
*
*
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2、机械搅拌发酵罐的结构
好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等
*
*
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
发酵工程第四章无菌技术
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
蒸汽
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽Βιβλιοθήκη 放汽冷却水无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
dN kN dt
ln Nt kt N0
t 2.303/klogN0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
蒸汽
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽Βιβλιοθήκη 放汽冷却水无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
dN kN dt
ln Nt kt N0
t 2.303/klogN0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
发酵工业无菌技术演示教学
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
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都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
❖ 青霉素：怕染细短产气杆菌 ❖ 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 ❖ 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 ❖ 柠檬酸：怕染青霉菌 ❖ 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 ❖ 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 种子扩大时期染菌：灭菌后弃去 ❖ 发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，
柠檬酸发酵
c. 染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH
下降，黄曲霉自溶。 d. 青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
❖ 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
❖ 消毒与灭菌的区别 ❖ 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
❖ 消耗营养 ❖ 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离
困难 ❖ 改变pH ❖ 分解产物 ❖ 噬菌体破坏极大
2. 染菌危害的具体分析
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 ❖ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，
有关细菌耐热性的特性
每毫升芽孢数
10000
（1）热力致死速率曲线或活菌
残存数曲线
1000
100
D
10 0
1D 2 D 3D 4D 5D
加热时间（分）
图1 热力致死速率曲线
微生物及其芽孢的热处理死 亡数是按指数递减或按对数 循环下降的。
若以纵坐标为物料单位值内 细胞数或芽孢数的对数值， 以横坐标为热处理时间，可 得到 一直 线 ——热 力致 死速 率曲线或活菌残存数曲线。
❖ 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
❖ 肉汤培养检查法 ❖ 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
1 2
污染原因分析
❖ 主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
（2）D值
❖ 图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟） 就是D值（Decimal reduction time）。也就是直线斜率 的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。
❖ D值的定义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致 死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数 时所需要的时间。
产酸产气
❖ 操作不当造成染菌 ❖ 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
❖ 物料、培养基、中间补料要灭菌； ❖ 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； ❖ 好气发酵通入的空气要除菌； ❖ 种子无污染；接种无菌操作过关； ❖ 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
❖ D值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性 越强。
❖ 因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。 ❖ 注意：D值不受原始菌数影响 ❖ D值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境
和其它因素而异。
部分食品中常见腐败菌的 D 值
腐败菌
腐败特征
低 嗜 嗜热脂肪芽孢杆菌
平盖酸败
酸 热 嗜热解糖梭状芽孢杆菌
重新接种 ❖ 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理，处理方法
应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细 菌。 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通 风加大，加速产酸。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
预防
❖ 培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
❖ 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。
❖ 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化。
1. 染菌的检查与判断
❖ 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
预防
❖ 种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
❖ 过滤空气带菌的防治 ❖ 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
❖ 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴 拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑 件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念：灭菌、消毒、除菌、防腐
❖ 灭菌（sterilization）：用化学或物理方法杀死物料或设备 中所有有生命物质的过程。 消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死空气、地表 以及容器和器具表面的微生物。 除菌（degermation）: 用过滤方法除去空气或液体中的微 生物及其孢子。 防腐（antisepsis）: 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。
较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 ❖ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染
菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生 长和合成代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 ❖ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。
❖ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
（2）染菌种类对发酵的影响
❖ 青霉素：怕染细短产气杆菌 ❖ 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 ❖ 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 ❖ 柠檬酸：怕染青霉菌 ❖ 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 ❖ 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 种子扩大时期染菌：灭菌后弃去 ❖ 发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，
柠檬酸发酵
c. 染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH
下降，黄曲霉自溶。 d. 青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
❖ 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
❖ 消毒与灭菌的区别 ❖ 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
❖ 消耗营养 ❖ 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离
困难 ❖ 改变pH ❖ 分解产物 ❖ 噬菌体破坏极大
2. 染菌危害的具体分析
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 ❖ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，
有关细菌耐热性的特性
每毫升芽孢数
10000
（1）热力致死速率曲线或活菌
残存数曲线
1000
100
D
10 0
1D 2 D 3D 4D 5D
加热时间（分）
图1 热力致死速率曲线
微生物及其芽孢的热处理死 亡数是按指数递减或按对数 循环下降的。
若以纵坐标为物料单位值内 细胞数或芽孢数的对数值， 以横坐标为热处理时间，可 得到 一直 线 ——热 力致 死速 率曲线或活菌残存数曲线。
❖ 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
❖ 肉汤培养检查法 ❖ 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
1 2
污染原因分析
❖ 主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
（2）D值
❖ 图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟） 就是D值（Decimal reduction time）。也就是直线斜率 的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。
❖ D值的定义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致 死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数 时所需要的时间。
产酸产气
❖ 操作不当造成染菌 ❖ 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
❖ 物料、培养基、中间补料要灭菌； ❖ 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； ❖ 好气发酵通入的空气要除菌； ❖ 种子无污染；接种无菌操作过关； ❖ 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
❖ D值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性 越强。
❖ 因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。 ❖ 注意：D值不受原始菌数影响 ❖ D值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境
和其它因素而异。
部分食品中常见腐败菌的 D 值
腐败菌
腐败特征
低 嗜 嗜热脂肪芽孢杆菌
平盖酸败
酸 热 嗜热解糖梭状芽孢杆菌
重新接种 ❖ 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理，处理方法
应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细 菌。 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通 风加大，加速产酸。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
预防
❖ 培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
❖ 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。
❖ 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化。
1. 染菌的检查与判断
❖ 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
预防
❖ 种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
❖ 过滤空气带菌的防治 ❖ 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
❖ 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴 拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑 件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念：灭菌、消毒、除菌、防腐
❖ 灭菌（sterilization）：用化学或物理方法杀死物料或设备 中所有有生命物质的过程。 消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死空气、地表 以及容器和器具表面的微生物。 除菌（degermation）: 用过滤方法除去空气或液体中的微 生物及其孢子。 防腐（antisepsis）: 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。
较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 ❖ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染
菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生 长和合成代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 ❖ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。
❖ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，