分子克隆常用技术

分子克隆常用技术
一、核酸的纯化
在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。

其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。

氯仿抽提核酸的溶液即可。

每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。

然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。

这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。

继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。

①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿。

②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。

③12000×g室温离心15秒。

④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。

⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。

二、核酸的浓缩
应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。

在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA 或RNA，也可定量回收。

回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。

具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V
无水乙醇，混匀，放冰水浴中15－30min，取出目测平衡，0－4度，12000g，离心10min。

吸弃上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗涤离心2min。

吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。

单价阳离子盐溶液
*：当加醋酸铵时，需加入DNA液的V/2。

单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。

当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。

含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂
要70%乙醇中仍保持可溶。

DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。

三、DNA、RNA的定量
准确的方法是紫外分光光度法。

但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。

用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收，然后，按IA260相当于50μg/ml
双链DNA。

40μg/ml单链DNA或RNA及20μg/ml单链寡核苷酸。

计算你的样品含量。

260nm和280nm两处读数的比值（A260/A280），可反映核酸的纯度。

DNA 和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。

可将样品纯化后再作定量测定。

有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光带的强度，即可大致判断出样品中的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物
（一）琼脂糖凝胶电泳
可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。

本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。

DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA分子的大小：线奖双链DNA 分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。

据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。

②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。

因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段
不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。

④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。

但是压增高时，大分子
量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。

为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段
DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克丙烯酰胺，1克双丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它来配制所需浓度的凝胶。

每100ml上述液体加30μl四甲基乙胺（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温温箱内，以促进聚合。

聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾入
1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。

一般所用电压1-8v/cm，随时观察标记染米的迁移。

在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中，标记染料迁移速率与下述DNA片段的速率相同
标记染料在PAG中的迁移*
*这些数字是与染料共同迁移的DNA片段的近似大小（以bp计）。

电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外灯下观察电泳结果。

（三）分子量参照物
为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。

最常用的分
子量参照物是 H indⅢ消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125
在微型离心管中乙醇沉淀的标准方法
(1)估计DNA溶液的体积。

(2)调整单价阳离子的浓度。

若DNA溶液中含有高浓度的盐，可用TE(pH8.0)
稀释，否则加入表A8-1列出的一种盐。

如果DNA溶液的体积不超过400ul可在单个微型离心管中进行沉淀，体积较大时可分成数管，或者在适宜于中速离心或超离心的离心管中进行离心。

(3)充分混匀溶液，准确加入2倍体积的冰冷乙醇，再充分混匀溶液。

将此
含乙醇的溶液置冰上使DNA沉淀形成。

一般放置15-30min就足够了。

但如果DNA分子太小(小于100个核苷酸)或者DNA的含量太低(低于0.1ug/ml)则需把在冰上放置的时间延长到1h以上并加入MgCl2至终浓度0.01mol/L。

DNA可在含乙醇的溶液中于0℃或-20℃无限期地
保存。

(4)于0℃离心回收DNA。

在多数情况下于最大转速离心10min就足够了。

然而如以上所述，在沉淀低浓度DNA(低于20ng/ml)或非常小的片段时则需要延长离心的时间。

图A8-2 吸出上清液
手持打开盖子的微型离心管成一定角度，使沉淀物在上侧，将一个一次性吸头连至真空管道，从管内抽吸液体。

把吸头置于离心管下侧，恰好在液体的凹面以下。

随着液体的吸出，可将吸头移向管底。

抽吸要温和，以免沉淀吸入吸头，并应使吸头的尖部离开沉淀。

最后吸尽附着于管壁的液滴。

(5)用自动微量移液器或连于真空管道的一次性吸头(见图A8-2)小心移出上清液，注意不要扰动沉淀(有时沉淀是看不见的)。

用吸头吸尽附于管壁的所有液滴。

在沉淀比较珍贵的DNA样品时，最好暂时留存上清液，直至确定已回收
到沉淀的DNA后再废弃。

(6)加半管70%乙醇，于4℃以最高转速离心2min。

(7)重复第5步。

(8)将离心管于室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥干。

过去常用冻干机干燥沉淀，这一步不仅没有必要，而且也不适当，因为这样会引起小片段DNA(小于 400个核苷酸)的变性(Svaren et al，1987)，还大大降低大
片段DNA的收率。

(9)将DNA沉淀(沉淀常常是看不见的)重新溶解于适当体积的缓冲液(一般为
pH 7.6-8.0的TE)，用缓冲液充分漂洗管壁。

[注]i在微型离心管中离心之后，并非所有DNA沉淀都沉积在管底，沉积在管壁的DNA最多可达50%。

为了回收到所有DNA，应使液滴在管壁的适当部位来回滚动，可用微量加液器上的一次性吸头推动液滴。

ii可用1倍体积的异丙醇<!>代替2倍体积的乙醇沉淀DNA。

异丙醇沉淀的优点是离心液体的体积较小，但异丙醇挥发性较乙醇差而难于去除，另外有些溶质如蔗糖和氯化钠等在用异丙醇时更容易共沉淀。

总之，除非必须降低液体的体
积，一般最好用乙醇沉淀。

iii一般用乙醇从溶液中沉淀出来的DNA重溶于低离子强度的缓冲液如TE(p H8.0)中比较容易，偶尔在用含MgCl2或浓度高于0.1mol/L Nacl的缓冲液直接溶解DNA沉淀时可能要遇到一点困难。

因此最好是先用少量低离子强度的缓冲液将DNA溶解后再调节缓冲液的成分。

若样品不易溶于较小体积的缓冲液，可用多一些缓冲液溶解，再重新用乙醇沉淀。

第二次沉淀有助于去除多余的盐及可能妨
碍DNA溶解的其他成分。

用乙醇沉淀RNA
RNA可以用含2.5-3.0倍体积的乙醇从含有0.8mol/L LiCl、5mol/L醋酸铵或0.3mol/L醋酸钠的溶液中有效地沉淀下来。

选择上述哪一种盐要取决于其后RNA的用途。

由于十二烷基硫酸钾盐的极难溶，若要将沉淀得到的RNA溶于含S DS的缓冲液(如用寡聚dT-纤维素层析时就使用这种缓冲液)则应避免使用醋酸钾。

同样，如果RNA已溶于含有SDS的缓冲液中，沉淀时也不要用醋酸钾。

[注]用于沉淀RNA的溶液应是无RNA酶的(见第7章)。

用氯化锂沉淀大分子RNA
小分子RNA(如tRNA和5SrRNA)在离子强度高的溶液中可溶，而大分子RNA(如rRNA和mRNA)则不溶，可通过离心沉淀下来。

(1)测量样品的体积，加0.2倍体积无RNA酶的8mol/L LiCl，充分混匀，置
冰浴中至少2h。

(2)于0℃以15000g离心20min，弃上清，将沉淀下来的大分子RNA重溶于0.
2倍体积水中。

(3)重复1和2步。

(4)用2倍体积乙醇沉淀，从重悬的沉淀物中回收大分子RNA。

用微量浓缩器进行核酸的浓缩及脱盐
除乙醇沉淀外，超滤也是核酸溶液浓缩和脱盐的一种可供选择的方法。

这种方法不需要相的变化，在处理低浓度核酸时特别有用。

Millipore公司供有一种称为Microcon滤筒的离心超滤装置，可以有效地进行核酸的脱盐和浓缩。

下述方案及加注采自Millipore公司的网站()，详细说明可从该
网站上查找。

(1)选择一种型号的Microcon，其核苷酸截留值等于或小于待分离核酸的大
小(见表 A8-3)。

(2)如图A8-3所示，从提供的两只小管中取出一只，将Microcon滤筒插入
其中。

(3)浓缩时(不影响盐的浓度)，可移取最多达500ul的样品(DNA或RNA)加到样品池中，按说明书推荐的时间离心，转速不要超过表A8-3列出的离心力。

(4)若进行盐的交换，加适量适当的稀释液，使浓缩样品的体积至500ul。

按说明书推荐的时间离心，转速不要超过表A8-3列出的离心力。

欲使盐的浓度更低，必要时可重复整个步骤。

见表A8-3的脚注。

重要：样品池不要加得太满。

(5)从小管上取下样品池，倒置插入另一只小管中(在分析样品之前要留存滤
液)。

(6)在一只微型离心管中于500—1000g离心2min回收小管中的核酸。

(7)取下样品池，盖紧管盖保藏样品。

图A8-3 用Microcon超离心进行核酸溶液的浓缩及脱盐
表A8-3 微型浓缩gSMic忱on的核苷酸截留值
注：注意单纯超滤是不会改变缓冲液组成的。

在Micrpcon中离心浓缩样品的盐浓度与原始样品的盐
浓度相同。

脱盐时可在浓缩的样品中加水或缓冲液至原先体积，再重新离心(称作不连续渗滤)。

这种脱盐的方式与超滤的浓缩系数有关。

举例来说，一份含100mmol/L盐的500ul样品浓缩至25ul时(浓缩系数为20)，则样品中95%的盐被去除，而样品中的盐浓度仍为100mmol/L。

再将样品用水稀释至500ul时盐的浓度降至5mmol/ml，再将此稀释的样品浓缩至25弘1可去除原先总量的99%的盐，这时浓缩样品盐浓度为0.25mmo l/L(译者注：原文有误，0.25mmol/L是再将此浓缩样品用水稀释至500ul后的浓度)。

若欲脱盐更彻底一些，可再进行一次溶解和离心的循环，即可脱去原先99.9%的盐量。

*ss表示单链，ds表示双链。

用丁醇抽提法浓缩核酸
在用仲丁醇(异丁醇)或正丁醇<!>抽提水溶液时，一些水分子会分配到有机相中，抽提数轮之后能够显著降低核酸溶液的体积。

这个方法可降低稀核酸溶液的体积，以致容易通过乙醇沉淀加以回收。

(1)测量核酸溶液的体积，加等体积异丁醇，用旋涡混合器混匀。

加入过多异丁醇会除去溶液中的全部水分而导致核酸沉淀。

如果发生这种情况，可在有机相中加水，
直到重新出现水相(其中含有核酸)。

(2)在微型离心管中以最高转速室温离心20s，或用台式离心机1600g离心1
min。

用自动微量移液器移出并弃掉上层(异丁醇层)。

(3)重复1和2步直至水相达到所需体积。

由于异丁醇抽提并不能除盐，水溶液中的盐浓度会随溶液体积减小而成比例地增高。

可通过离心柱层析或乙醇沉淀将核酸转换到所需的缓冲液中。