高效液相色谱使用

第一节高效液相色谱检测法
高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。

通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。

所用的固定相为大于１００ｕｍ的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。

这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。

而高效液相所用的固定相粒度小（５ｕｍ-１０ｕｍ）、传质快、柱效高。

高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是２０世纪６０年代后期发展起来的一种分析方法。

近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。

世界上约有８０％的有机化合物可
以用ＨＰＬＣ来分析测定。

一、高效液相色谱分析原理
（一）高效液相色谱分析的流程
由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。

被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。

废液流入废液瓶。

遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。

这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

（二）高效液相色谱的分离过程
同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。

它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。

分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。

分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。

组分Ｂ的分配系数介于Ａ，Ｃ之间，第二个流出色谱柱。

若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，
达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。

其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。

所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

二、高效液相色谱的类型
（一）吸附色谱
在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。

所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。

通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机
溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。

吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为１０％或更少一些。

如有可能，可进一步减小百分数。

因为高浓度的醇会减少
填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。

（二）分配色谱
１. 正相分配色谱
正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子
型物质。

２.反相分配色谱
这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。

通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的ＰＨ值，例如，如果样品有一个—ＣＯＯＨ基团，使流动相的ＰＨ值是偏向酸性的，由于抑制了—ＣＯＯＨ基团的电离而加强了保留。

这个方法叫离子抑止
法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。

在调节ＰＨ值中，保持ＰＨ值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在ＰＨ＝２-９，然而，当加入盐以后，最好使其ＰＨ＝７.５-８或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广
泛的ＰＨ值。

（三）离子交换色谱
这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按
照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。

离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。

在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、ＰＨ及盐的种类等都对保留值有很大的影响。

在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。

因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用ＮａＣＩ或其他的氯化物盐类。

根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在２１０ｎｍ，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适
的。

（四）凝胶色谱
凝胶色谱不同于以上三种分离方法。

凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。

这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。

具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。

因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。

通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。

凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。

１.凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱（ＧｅｌＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＰＣ。

此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如ＰＶＣ，ＰＳ，ＡＢＳ等等，而所用的洗脱液有ＴＨＦ，Ｃ
ｈｌｏｒｏｆｏｒｍ等等。

２.凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（ＧｅｌＦｉｌｔｒａｒｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＦＣ。

此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、
缓冲液等等。

凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。

按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。

而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。

根据它对溶剂的适用范围又可分
为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。

三、高效液相色谱法在分析检测上的应用
（一）食品中山梨酸、苯甲酸的测定
１. 原理
样品加温除去二氧化碳和乙醇，调ＰＨ至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根
据保留时间和峰面积进行定性和定量。

２.试剂和溶液
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水，溶液为水溶液。

（１）甲醇：优级纯，如果是分析纯，需重蒸。

（２）稀氨水：１+１溶液，氨水加水等体积混匀。

（３）０.０２ｍｏｌ／Ｌ乙酸铰溶液：称取１.５４ｇ乙酸按，加水至１０００ｍＬ，溶解，经滤膜（０.
４５ｍ）过滤。

（４）２０ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液：称取２ｇ碳酸氢钠（优级纯）加水至１００ｍＬ，振摇溶解。

（５）苯甲酸标准储备液：准确称取０.１０００ｇ苯甲酸，加２０ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液５ｍＬ，加热溶解，移入１００ｍＬ容量瓶中，加水定客至１００ｍＬ，摇匀，此溶液苯甲酸含量为１ｍｇ／１ｍＬ，
作为储备液。

（６）山梨酸标准储备液：准确称取０.１０００ｇ.山梨酸，加碳酸氢钠溶液（２０ｇ／Ｌ）５ｍＬ，加热溶解，移入１００ｍＬ容量瓶中，加水定容至１００ｍＬ，山梨酸含量为１ｍｇ／１ｍＬ，作为储备
溶液。

（７）苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液１０.０ｍＬ，放入１００ｍＬ容量瓶中，加水至刻度。

此溶液含苯甲酸、山梨酸各０.１ｍｇ／ｍＬ。

经滤膜（０.４５ｍ）过滤（同
时测定糖精钠时，可加入糖精钠标准储备液）。

３.仪器高效液相色谱仪（带紫外检测器）。

４.测定方法
（１）样品处理
１.汽水、饮料、果汁类：（汽水需微温搅拌除去二氧化碳）吸取２.０ｍＬ样品，加入已装有中性氧化铝（３ｃｍ*１.５ｃｍ）的小柱中，过滤，弃去初滤液，然后用流动相洗脱苯甲酸，接收于２５ｍＬ带塞量简中，洗脱至刻度，摇匀。

此液通过微孔滤膜后进样。

３.配制酒类：称取１０.０ｇ样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（１+１）调节ＰＨ约７，加水定容至适当体积，经滤膜（０.４５ｕｐ）过滤。

（２）高效液相色谱参考条件
１.色谱柱：ＹＷＧ-Ｃ１８４.６*１５０ｍｍ５ｕｐ，或其他型号Ｃ１８柱。

２.流动相：甲醇+乙酸铰溶液（０.０２ｍｏｌ／Ｌ）（５+９５）。

３.流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ。

４.进样量：１０ｕｌ。

５.检测器：紫外检测器，波长２３０ｍｍ，灵敏度０.２ＡＵＦＳ。

根据保留时间定性、外标峰面积法定量。

５.分析结果的表述
式中ｘ———样品中苯甲酸（或山梨酸）的含量ｇ／ｋｇ（Ｌ）
ｍ１———进样体积中苯甲酸（或山梨酸）的质量ｍｇ
Ｖ２———进样体积ｍＬ
Ｖ１———样品稀释总体积ｍＬ
ｍ２———样品质量ｇ
６.其他
本方法可以同时测定山梨酸、苯甲酸、糖精钠。

（二）四种人工合成甜味剂（糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、甜味素）和柠檬酸的测定
１.原理
目前在世界范围内使用最多的人工合成甜味剂主要包括糖精钠、天门冬酚苯丙氨酸甲酯（又名甜味素）、环己基氨基磺酸钠（又名甜蜜素）和乙酸磺胺酸钾（又名安赛蜜）。

在实际生产中，这些甜味剂可以单独使用，也可以以混合物的形式同时使用。

由于技术、安全和成本上的原因，几种甜味剂同时使用的情况更为常见。

此外，在实际使用甜味剂时，往往同时添加柠檬酸以掩盖某些甜味剂的苦味，改善口感。

以上所有的分析物在碱性溶液中均以阴离子的形式存在，因此可以采用高效阴离子交换色谱法同时进行测定。

采用高效液相色谱法测定人工合成甜味剂最常用的检测方式是紫外检测方式，但是由于甜蜜素和柠檬酸不具有紫外生色团，因此不适用于这两种物质的测定。

由于甜味素经过抑制后由阴离子变成了中性分子，
因此电导检测方式也不适用于甜味素的测定。

为此，可以采用两种检测方式进行串联，同时对所有分析物进行测定：甜味素由紫外检测器进行测定，甜蜜素和柠檬酸由电导
检测器进行测定，安赛蜜和糖精钠由紫外和电导检测器共同测定。

在２ｕｇ-１００ｕｇ／ｍＬ范围内，所有分析物的浓度与峰面积呈良好线性关系。

采用紫外检测时，糖精钠、甜味素、安赛蜜的检出限（信噪比为３）分别为０.０１９ｕｇ／ｍｌ、０.０３５ｕｇ／ｍＬ、０.０４４ｍｇ／ｍＬ；采用电导检测时，糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、柠檬酸的检出限分别为０.２６ｕｇ／ｒｎＬ、０.１６ｕｇ／ｍＬ、０.２３ｕｇ／ｍＬ、０.２２ｕｇ／ｍＬ。

本方法适用于餐桌甜料和液体饮料中上述物质的测定。

２.试剂
安赛蜜为Ｈｏｅｃｈｓｔ公司产品，其他甜味剂均为Ｓｉｇｍａ公司产品。

其余试剂均为优级纯或分析纯，水为二次去离子水。

甜味剂和柠檬酸标准溶液（１ｍｇ／ｍＬ）：准确称取糖精钠、甜味素、甜蜜素、安赛蜜和柠檬酸各０.１０００ｇ，分别溶于１００ｍＬ水中。

于４设氏度冰箱中保存。

３.仪器
（１）色谱系统。

美国Ｄｉｏｎｅｘ公司Ｄｘ-５００型离子色谱仪，ｌｏｎＰａｃＡＧ４Ａ-ＳＣ保护柱，ｌｏｎＰａｃＡＳ４Ａ-ＳＣ分析柱。

ＡＤ２０型吸光度检测器与ＥＤ４０型电化学检测器（电导检测方式）串联使用。

ＡＳＲＳ-Ｉ型阴离子自身再生抑制器（外接水方式），工作电流３００ｍＡ。

淋洗液依次通过ＡＤ２０型吸光度检测器、ＡＳＲＳ-Ｉ型阴离子自身再生抑制器、ＥＤ４０型电化学检测器，流速为$１.０ｍＬ／ｍｉｎ。

进样量５０Ｌ仪器控制与数据采集均由ＰｅａｋＮｅｔ色谱工作站完成。

（２）色谱条件。

采用梯度淋洗方式：淋洗液Ａ为１.０ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３溶液，淋洗液Ｂ为１２.５ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３溶液。

采用电导和波长切换>紫外方式同时进行检测。

系统运行程序如下：０ｍｉｎ-４.５ｍｉｎ，淋洗液Ａ１００％，淋洗液Ｂ０％，检测波长１９０ｎｍ；４.５ｍｉｎ-５.５ｍｉｎ，淋洗液Ａ由１００％降为０％，淋洗液Ｂ由０％升为１００％，检测波长１９０ｎｍ；５.５０ｍｉｎ-６.００ｍｉｎ，淋洗液Ａ０％，淋洗液Ｂ１００％，检测波长１９０ｎｍ；６.００ｍｉｎ-２８.００ｍｉｎ，淋洗液Ａ０％，淋洗液Ｂ１００％，检测波长２０６ｎｍ；２８.１０ｍｉｎ-４０.００ｍｉｎ，淋洗液Ａ１００％，淋洗液Ｂ０％，检测波长１９０ｎｍ。

当程序运行至６.００ｍｉｎ检测波长由１９０ｎｍ切换到２０６ｎｍ时，检测器吸光度抑制为“零”，以保持基线平稳。

保留时间定性，峰面积定量。

４. 操作步骤
准确称取３０ｍｇ固体样品（粉状餐桌甜料），直接溶于水中，定容至２５ｒｎＬ。

果汁样品直接用水稀释。

称取适量的碳酸型饮料在室温下超声脱气５ｍｉｎ，然后用水稀释。

所有样品稀释液经０.２ｕｍ滤膜后进样测定。

各种分析物的保留时间大致为：甜味素３ｍｉｎ（紫外检测方式）、甜蜜素４ｍｉｎ（电导检测方式）、安赛蜜１４ｍｉｎ（电导检测方式）、糖精钠１９ｍｉｎ（电导检测方式）、柠檬酸２４ｍｉ
ｎ（电导检测方式）。