基因工程菌稳定性分析(ppt 48张)

菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生 长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
质 1 粒 拷 贝 数 0.5
950
40 0 0.2 0.4
生长数率/h GXU
β-半乳糖苷酶工程菌的连续养
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主
菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒 不稳 定性的研究过程中, 人们关注最多的,通常是质粒的
由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统， 从而保证了质粒的高度稳定。

GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2 随机分配
在细胞分裂过程 中质粒拷贝数在两个 子细胞中随机分配。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
影响质粒载体稳定性的主要因素

新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应

GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
三、质粒拷贝分配到子细胞的途径
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配 和随机分配两种不同的方式。 1 主动分配的方式有两种:

平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝
配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机 分配 GXU

第二节 质粒载体不稳定现象及类型
分离不稳定性。
GXU
第四节 提高质粒稳定性的方法

高密度培养


基因工程菌
选择培养基


周期操作
固定化基因工程菌
结构重排导致无法正常表达的突变体。
GXU

第二节 质粒载体不稳定现象及类型
二、质粒载体不稳定性的类型

结构不稳定
指结构 ( 序列 ) 不稳定性 , 即重组质粒上某一区域的
DNA 序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象, 导致 其表观生物学功能的丧失;

分离不稳定
指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。GXU
寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载 体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入 片段大小存在相关性。


决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种 主要的因素：一、质粒 DNA 分子间的重组频率；二、含 GXU 质粒寡聚体细胞生长速率。
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
1. 结构不稳定
原因： DNA 的丢失，插入和重排。人工构建的多个 串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体 及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的 不稳定性。 共 同 特 征 ： 同 向 重 复 序 列 之 间 的 同 源 重 组 （ short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换 大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产 生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。
具有低差度分布 特性的质粒载体相当 的稳定性，具有高差 度分布特性的质粒载 体稳定性较差。位于 后者的这种分布的低 拷贝数的一段产生无 质粒载体细胞的频率 相当高。

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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
3. 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应

质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳 定性的重要原因之一。
应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技
术工业化的瓶颈。
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
一、质粒载体不稳定的现象：

克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细
胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的 稳定性；

可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加；

产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体；

差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒 载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质 粒载体拷贝数差异程度，简称差度。 无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平 均值数决定的。
差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳 定的原因之一。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素

GXU
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2. 分离不稳定
原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning ）所造成的质 粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每 个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生 的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。
目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体
导入受体菌-筛选导入成功的受体菌
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第一节 基因工程菌的概述
三、质粒的稳定性问题
基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过 载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表 达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、 氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔


GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
1. 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。 即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成 正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢 的时间就越长。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
2. 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响
基因工程菌稳定性分析
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基因工程菌稳定性分析
第一节 基因工程菌的概述
第二节 第三节
第四节 第五节
质粒载体不稳定现象及类型 提高质粒稳定性的方法
影响质粒载体稳定性的主要因素 对NHase重组质粒稳定性分析
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第一节 基因工程菌的概述
一、 基因工程菌的定义
基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用 基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其 表达所需蛋白的重组菌。 二、基因工程菌构建的基本路线
影响质粒重组的突变 同样也会影响质粒的稳 定性。实验观察表明，

在 重 组 缺 陷 (rec-) 的 大 肠 杆菌寄主细胞中，基因 工程常用载体 pBR322 和 pUC当以单体形式存在时 最稳定。随着质粒寡聚 体比例的逐渐上升，其 稳定性就相应的下降。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素