固定化酶资料
酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
●
外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
●
内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
● ● ●
固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
●
助因子的反应；
●
三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
●
●
●
1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
第九章 固定化酶
在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型：
1、构象改变和屏蔽效应
构象改变：酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使
酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下 降。这种效应难以定量描写也难以预测。通常出现在吸附法 和共价键结合法。
立体屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成
3、偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分 子上的非必需侧链基团，必需在温和的pH、中等离子强度 和较低温的缓冲液中进行。
（三）交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间， 或酶与惰性蛋白间进行交联反应，制备固定化酶的力法。 可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的交联试剂：戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮 联苯胺-2，2’二磺酸、 双重氮联苯胺等。
（四） 包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的 方法称为包埋法。 分类：根据载体与方法不同，分为： 网格型（凝胶包埋法） 微囊型（半透膜包埋法）
1、网格型： 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定 形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。
聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意图
什么是固定化酶？ 水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
定义：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束
缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用； 曾称其为水不溶酶或固相酶。
第一节 概述
固定化酶的优点
3、pH的变化
PH对酶活性的影响：
（1）改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离
第四章固定化酶.
第四章固定化酶固定化酶的是指是具有催化活性蛋白质的固定化，因此固定化酶一般为具有各种性状的颗粒，其反应过程必须在颗粒水平上进行描述和表达。
它的显著特征是：在描述其反应过程动力学时，必须包含有反应物系从液相主体扩散到颗粒内、外表面的传递速率的影响。
第一节固定化酶概论酶的催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点，但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。
为了克服这些问题，20世纪60年代酶固定化技术应运而生。
它是模拟体内酶的作用方式（体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应），通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971年酶工程会议上被推荐使用的。
Trevan在1980年给出了固定化酶的定义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后使其不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。
其实，固定化酶并不是新的物质，例如，胞内酶是在细胞内起作用的，类似于用包埋方法制成的固定化酶。
因此，固定化酶研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近其原始状态下进行的反应。
对各种酶的固定化技术进行积极的研究与开发始于20世纪50年代，通过重氮化共价结合法将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等固定在聚氨基苯乙烯树脂上；1963年，利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶；1969年，日本的一家制药公司首次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。
通常的生物催化剂，如酶或细胞同其它溶质一样，分散在溶剂或溶液中，可以自由移动，称为游离酶或游离细胞。
若通过固定化技术将酶固定于载体表面或其内部，则与液相主体相分离，形成了固定化生物催化剂，即固定化酶。
固定化酶
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
第九章固定化酶
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
第五章 固定化酶讲解
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
固定化酶的相关知识
固定化酶的相关知识固定化酶的定义：固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上, 进行催化生产,因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。
固定化酶的特点：优点:1.易于将固定化酶与底物产物分高,便于后续的分离和纯化;2.可以在较长时间内连续生产;3.酶的稳定性和最适温度提高;4.酶反应条件容易控制;5.可以增加产物的收率,提高产物质量;6.酶的使用效率高,使用成本低;7.适于产业化连续化自动化生产缺点:1.在固定化过程中,酶活力会损失;2.生产成本提高,工厂初期投资大;3.只能用于水溶性底物,适合于小分子;4.不适宜于多酶反应,还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应固定化酶的方法：酶的固定化方法主要有四类：吸附法、包埋法、共价键法、交联法。
吸附法：吸附法是最简单的固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。
物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、硅藻土、多空玻璃、多孔陶器、硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等；离子吸附法是酶与载体通过范德华力、离子键和氢键等作用力固定。
包埋法：包埋法即酶在载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)中发生聚合、沉淀或凝胶化而被固定的方法。
包埋法常用的载体主要有：明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。
共价键法：共价键法是利用化学方法将载体活化，再与酶分子上的某些基团反应，形成共价的化学键，从而使酶分子结合到载体上。
该方法使用广泛，固定化酶与载体连接牢固，不易脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。
共价键结合法常用的载体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。
交联法：使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。
与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化，二者的区别在于交联法使用了交联剂。
常用的交联剂有戊二醛、蹂酸。
《固定化酶》课件
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
酶的固定化方法
酶的固定化方法1. 基本介绍酶的固定化技术是将活性酶分子吸附到不溶性载体上的技术，这些载体包括有机支架，金属合金，无机型号，复合支架，生物大分子和石墨。
与溶液型酶相比，固定化酶具有良好的耐热性，耐久性和稳定性。
可以在恒定的温度和pH值下多次重复使用，这使得固定化酶可以广泛应用于生物工程，食品技术和保健产品的制备中。
2. 固定化酶的优势（1）保持酶活性。
固定化酶能够有效地防止反应补充的游离酶的出现，充分保持其最初的功能和活性，极大地提高了反应中酶的活性和稳定性；（2）提高回收率。
固定化酶具有彼此独立的结构，可以在反应中迅速回收，特别是对于产物特性复杂的反应；（3）可扩展性强。
固定化酶可以根据应用环境的不同和操作条件的可控性，调整载体的参数；（4）可以重复使用。
固定化酶可以多次使用，可以充分利用其过程效率，减少反应次数，降低成本，提高产物纯度；（5）灵活性好，操作更加简单。
当需要调节反应中的酶功效时，可以通过简单的调节载体参数来控制。
3. 固定化酶的技术原理固定化酶主要是通过生物相容性，物理锁定，化学结合和选择性结合四种技术原理。
（1）生物相容性原理。
根据酶的物理化学性质，通过将酶与具有吸附效果的固定化载体搅拌至溶解，使酶外部改变，从而结合到固定体上，形成固定化酶。
（2）物理锁定原理。
通过将因子与特定形状的载体结合，物理力把酶和载体牢牢地结合在一起，形成固定化酶。
（3）化学结合原理。
通过改变因子的外部，形成含有非共价或共价结合的表面带正或负电荷，从而使酶能够结合至具有与之相匹配的电荷的固定体上，形成固定化酶。
（4）选择性结合原理。
通过给载体表面施加疏水或疏水性物质，形成选择性的活性基团，使载体具有低特异性，从而将酶与相应特异性表面结合，形成固定化酶。
4、固定化酶的方法固定化酶有多种固定化方法，如电冻定，脂质包覆，杂化，冻胶，结合支架和表面修饰等。
（1）电冻定：电冻定是一种通过电泳技术将酶通过载体电泳固定在离心管内壁上的一种方法。
固定化酶定义
固定化酶定义固定化酶固定化酶是指将天然酶或人工合成的酶固定在载体上，形成固定化酶催化剂的一种技术。
定义1.固定化酶：固定化酶是将酶与固体载体相结合形成的催化剂。
固定化酶具有较高的催化活性、稳定性和重复使用能力，可应用于多个领域。
2.载体：载体是指将酶固定在其上的固体材料。
常用的载体材料包括炭、纤维素、凝胶、金属氧化物等。
3.固定化技术：固定化技术是将酶与载体结合的过程，常见的固定化技术包括吸附、交联和共价结合等。
理由固定化酶相比于游离酶具有以下优势，使其在许多领域得到广泛应用：1.增强催化活性：固定化酶在催化反应中通常具有较高的催化活性，能够在相对温和的条件下实现高效催化。
2.提高稳定性：固定化酶能够耐受极端条件（如高温、酸碱环境等），具有更长的寿命和持久的催化效果。
3.可重复使用：固定化酶在催化反应后可以通过简单的分离和再生步骤进行回收和重复使用，降低了生产成本。
4.易于分离产物：固定化酶的载体通常具有良好的物理化学特性，可以实现催化产物的高效分离和纯化。
书籍简介《固定化酶：原理与应用》该书通过系统的介绍固定化酶的原理、固定化技术以及应用案例，深入探讨了固定化酶在各个领域的潜在应用价值。
内容包括：1.固定化酶的原理和分类；2.常见的固定化技术及其优缺点；3.固定化酶在生物医药、生物能源、环境保护等领域的应用；4.商业化生产中的固定化酶案例分析；5.未来固定化酶研究的发展趋势和挑战等。
本书内容深入浅出，既适合科研人员了解固定化酶的基本知识，也适合工程技术人员应用固定化酶技术解决实际问题。
无论是酶学研究新手还是经验丰富的专业人士，都能从中获得宝贵的参考和指导。
总结固定化酶是一种具有高催化活性、稳定性和重复使用能力的酶催化剂。
通过固定化技术，酶能够与载体结合从而实现其优势的应用。
固定化酶在各个领域具有广泛的应用前景，并且已经在医药、能源等领域取得了重要的成果。
《固定化酶：原理与应用》一书对固定化酶的原理、技术与应用进行了深入分析和讨论，是该领域学术研究者和工程技术人员的重要参考资料。
高三生物固定化酶知识点
高三生物固定化酶知识点生物固定化酶是一种将酶固定在载体上的技术，被广泛应用于生物工程和工业生产中。
通过固定化酶，可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性，以达到更高的产量和效率。
本文将从固定化酶的原理、方法和应用领域等方面进行探讨。
一、固定化酶的原理固定化酶的原理是将酶通过化学交联、吸附或共价键结合等方法与载体材料结合，形成酶固定化的复合物。
这种复合物在特定条件下可以实现酶的固定化，成为一种高效的酶催化系统。
固定化酶的原理主要基于两个方面：一是通过酶与载体的物理或化学结合，增强酶的稳定性，延长其半衰期；二是通过载体的特性改变酶的反应环境，提高酶的催化效率。
二、固定化酶的方法固定化酶的方法主要分为三类：物理吸附法、化学固定法和共价固定法。
物理吸附法是将酶与载体通过静电相互吸引力、疏水效应或表面张力等物理力作用结合在一起。
这种方法简单易行，但不稳定，酶容易从载体上脱落。
化学固定法是利用肽键或二硫键等化学键的形成，使酶与载体牢固地结合在一起。
这种方法稳定性较高，但需要进行特定的化学修饰和反应条件控制。
共价固定法是通过酶分子上的特定官能团与粘接剂反应，形成共价键结合。
这种方法稳定性最高，但操作较为繁琐。
三、固定化酶的应用领域固定化酶广泛应用于医药、食品、环境工程等领域。
在医药领域，固定化酶可以用于酶替代治疗，例如胰岛素固定化酶用于糖尿病治疗。
此外，固定化酶还可以用于制备药物中间体和药物合成等过程中，提高反应效率和纯度。
在食品领域，固定化酶可以用于食品加工和酿造过程中的酶催化反应。
例如，酶固定化技术可以用于啤酒生产中的淀粉糖化、果汁酶解和乳酸酶发酵等工艺。
固定化酶可以提高生产效率和产品质量。
在环境工程领域，固定化酶可以用于废水处理、大气污染物降解和土壤修复等方面。
通过固定化酶技术，可以降低酶的使用成本和环境污染，同时提高反应效率和降解效果。
结语生物固定化酶是一项重要的生物工程技术，通过固定化酶可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性。
酶固定化
酶的固定化摘要：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
在催化反应中以固相状态作用于底物。
关键词：固定化酶；不溶于水；包埋法；活性中心；功能基团。
正文：固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。
是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶操作的注意事项1．活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。
2．功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。
3．酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
固定化的优点：1．不溶于水，易于与产物分离；2．可反复使用；3．可连续化生产；4．稳定性好。
固定化酶
究，并第一次实现了酶的固定化。
1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化 研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这 是世界上固定化酶用于工业的开端。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆
操作简单 处理条件温和 酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏
酶活回收率较高
离子结合法缺点：
载体和酶的结合力比较弱 容易受缓冲液种类或pH的影响
在离子强度高的条件进行反应时，酶易从载体上脱落
3．共价结合（偶联）法：
酶以共价键结合于载体的固定化方法，即将酶分 子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进 行共价结合的方法。
二、固定化酶的性质
酶的稳定性高，易从反应系统中分离，且易
于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存， 有利于自动化生产。
固定化酶的应用
在工农业生产、医药治疗、分析化学中都有
应用。
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
表 酶的各种固定固定化方法比较
载体结合法 固定化方 物理吸附法 离子结合 法 法 制备难易 结合程度 易 弱 易 中等
菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。
固定化酶的优点：
①酶的稳定性得到改进； ②酶可以反复利用； ③可以管道化，连续化及自动化； ④酶与产物易于分开，产物容易提纯； ⑤反应所需的空间小；
固定化酶的缺点：
①固定化时，酶活力有损失； ②增加了生产的成本，工厂初始投资大； ③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子 底物，对大分子底物不适宜； ④与完整菌体相比不适于多酶反应，特别是需 要辅助因子的反应； ⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。
理学食品酶学本固定化酶课件
（1）酶的底物为小分子化合物
一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，酶的底物为大分子化合物
当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%～17％。
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。
各固定方法的特点与比较
四、 固定化酶的特性
（一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性
酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
固定化酶资料
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团 • 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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（4）载体活化的方法
• A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
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（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
R3
H2O
R1
NH2NH
S
O O
N
R3
O OH
O OH
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
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7．固定化酶在基础理论研究中应用
• 阐明酶反应机理 • 揭示酶原激活机理
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酶亚基性质的研究
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研究蛋白质-核酸分子结构
• 连续的固定化酶柱进行DNA序列分析； • 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释
放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定 掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列； • ——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 • 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、 ATP磷酸化酶，荧光酶柱。
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（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。
分为：网格型和微囊型
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五、固定化后酶性质的变化
• 1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下 降，反应速度下降
• 原因：酶结构的变化
• 空间位阻
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2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高。 • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些 反而降低。 • （4） 对分解酶的稳定性提高。 • （5） 对变性剂的耐受力升高。
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1．网格型
• 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格 中，制成一定形状的固定化酶的方法。 也称为凝胶包埋法。
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2．微囊型包埋法
• 将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般 只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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各类固定化方法的特点比较:
比较项目 吸附法 物理吸附 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 底物专一性 适用性 易 弱 较高 可能 低 不变 酶源多 结合法 .共价键结合 难 强 低 不可能 高 可变 较广 离子键结合 易 中等 高 可能 低 不变 广泛 较难 强 中等 不可能 中等 可变 较广 较难 强 高 不可能 低 不变 小分子底 物、药用 酶 交联法 包埋法
双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为
壳状固定化酶。
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（2）交联包埋法
• 把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细 的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包 埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得 的固定化酶稳定性好。
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（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。 分为：网格型和微囊型
酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过 程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载 体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血 红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白 质共交联。
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双重固定法：
（1） 吸附交联法
• 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树 脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等
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共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团
• • • 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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（4）载体活化的方法
• • • • • A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交
• • • •
（一） （二） （三） （四）
吸附法 结合法 交联法 包埋法
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（一） 吸附法
• 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或 含酶菌体吸附在其表面上。 选择载体的原则: - 要有巨大的比表面积 - 要有活泼的表面 - 便于装柱进行连续反应 物理吸附法: -静止法 -电沉积法 -反应器上直接吸附法 -混合浴或振荡浴吸附法
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固定化后酶的考察项目：
• （1） 测定固定化酶的活力，以确定固 定化过程的活力回收率。
• （2） 考察固定化酶稳定性。
• （3） 考察固定化酶最适反应条件。
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评价固定化酶的指标:
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具
有的酶活力单位。
• 或：单位面积（cm2）的酶活力单 位表示（酶膜、酶管、酶板）。
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优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。 载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
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（二）结合法
• 1 离子键结合法 • 2 共价键结合法
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1 离子键结合法
• 酶分子 含有离子交换基团的固相载体 • 第一个离子结合法固定化酶： • DEAE — Cellulose • 固定化过氧化氢酶 • 第一个工业化的固定化酶： • DEAE-Sephadex A-50 • 固定化氨基酰化酶
联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
• 常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马
来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是
戊二醛。
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双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱 (shiff)。
第二章 固定化酶
一、什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
易于与产物分离； – 可反复使用； – 可装塔连续化生产； – 稳定性好。 缺点： -固定化过程中往往会引起酶的失活 -首次投入成本高 -大分子底物较困难
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三、固定化酶的方法
• 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 • 使用注意：pH、离子强度、温度
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2 共价键结合法
• （1）概念 • （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 • （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高 聚物、无机载体
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一 半所需要的时间（t1/2）
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• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定
化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。
•
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四、影响固定化酶性质的因素
1．酶本身的变化，主要是由于活性中心 的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等 发生了变化。 2．载体的影响 • （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶
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• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成
图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶 性的固定化酶。
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• 交联法有2种形式：
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂， 使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的 浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。