亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用_李瑞萍
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Key words hydrophilic interaction chromatography; basic drugs; separation
1 引言
碱性药物的分离一直是色谱界研究的热点。其 原因之一是在日益发展的制药业中, 很多新开发的 药物为强碱性化合物, 其药效和纯度的评价需用色 谱法。为得到碱性药物理想的色谱行为, 人们不断 开发新的色谱填料 及分离模式以 满足其需求。目 前, 以硅胶为基质的各种化学键合填料为固定相的 反相色谱仍占碱性药物分离的主导地位。但由于键 合不完 全, 碱 性化合 物常 与残 留的硅 羟基 发生 作 用[ 1,2] , 致使峰形严重拖尾。而且强极性碱性化合物 的亲水性很强, 在酸性 pH 条件下它们带的 净电荷
第 18 卷 第 11 期 2006 年 11 月
化 学 进展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol. 18 No. 11 Nov. , 2006
亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
李瑞萍1* 黄骏雄2
( 1. 三峡大学 Alan G. MacDiarmid 再生能源研究所 宜昌 443002; 2. 中国科学院生态环境研究中心 环境化学与生态毒理学重点实验室 北京 100085)
收稿: 2006 年 1 月, 收修改稿: 2006 年 5 月 * 通讯联系人 e-mail: amylee0289@ 163. com
使这些化合物用反相色谱很难保留和分离。因此必
须采用二次化学平衡的原理, 利用离子对色谱、离子 抑制或硅羟基掩 蔽剂等, 以保证良好的分 离效果。 但这些洗脱条件降低质谱检测灵敏度, 不能与质谱 兼容[ 3,4] 。以非极性或低极性有机溶剂为流动相、硅
Hydrophilic Interaction Chromatography and Its Applications in the Separation of Basic Drugs
Li Ruiping1* H uang Junxiong 2 ( 1. Alan G. MacDiarmid Research Institute of Renewable Energy, Chinese Three Gorges University, Yichang 443002, China; 2. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco- Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China)
摘 要 亲水作用色谱是采用极性固定相、高含量极性有机溶剂- 水相缓冲液为流动相的一种分离技 术, 它能有效地保留反相色谱中保留弱或不保留的强极性碱性药物。本文综述了以未键合硅胶为固定相的 亲水作用色谱分离碱性药物的机理、特点及其应用的最新进展。
关键词 亲水作用色谱 碱性药物 分离 中图分类号: O657. 7; O657. 63 文献标识码: A 文章编号: 1005- 281X( 2006) 11-1508-06
图 1 硅胶结构中硅羟基的存在形式 Fig. 1 The silanol species present in the silica structure
尽管碱性化合物在硅胶表面的保留机理复杂, 影响因素较多, 但普遍认为存在离子交换机理, 即在 硅胶固定相上, 极性的碱性化合物与带负电荷的硅 羟基进行弱的阳离子交换。Bidlingmeyer 等[ 12] 在普 通硅胶色谱柱上, 系统地研究了离子强度、pH 值、离 子交换容量及溶剂强度对溶质保留的影响, 证实了 碱性化合物在反相洗脱条件下以多种机理在硅胶柱 上保留。在一定 pH 条件下, 溶质的保留值随流动 相中无机盐浓度的增大而减小, 说明存在离子交换 机理。当离子强度一定时, 随着 pH 的增加, 所有离 子型有机胺类药物的保留逐渐增大, 当 pH 接近有 机碱 pK a 值时保留达到最大, 随后又降低。他们还 观察到, 当保持 pH 值和离子强度恒定时, 溶剂组成 与容量因子 kc之间成线性关系, 与典型的反相系统 类似。硅胶极 性弱 于反 相洗 脱剂, 硅氧 烷是 疏水 的[ 2] , 因此在高 pH 值的亲水作用色谱系统中, 碱性 药物的解离部分和未解离部分分别与硅胶表面亲水 性的 SiO- 和疏水性的硅氧烷作用。最近作者[ 14] 及 其他一些学者[ 15, 16] 也证实了 HILIC 模式下碱性化合 物在硅胶柱上类似的复杂保留机理。
Abstract Hydrophilic interaction chromatography ( HILIC) is a convenient method for separating basic drugs and their metabolites which have poor retent ion on reversed- phase column by passing highly polar organic- aqueous buffer mobile phase across a polar stationary phase. The mechanism and characterization of HILIC using silica columnPreversedphase elution system are described. In addition, the recent progress of its applications in the separation of basic pharmaceuticals is reviewed.
根据离子交换理论, 保留值 kc是溶质 pK a 值的 函数, 则保留受溶质 pK a 值的影响。Law[17] 采用 pH = 912 的甲醇- 乙酸铵缓冲液( 9B1) 为流动相, 研究了 69 种有机胺类药物的 pK a 值与保留之间的关系, 证 实 logkc与 pK a 值之间具有良好的线性相关性, 使离 子交换理论得到 了很好验证, 同时还发 现 log kc与 pK a 值之间的相关性受碱性中心或其附近取代基的 影响。Cox 等[ 13] 通过研究认为碱性化合物在硅胶柱 上的保留机理与其在色谱条件下所呈的状态有关, 呈离子型的有机胺类药物主要以阳离子交换作用保 留, 而非离子的则主要以疏水作用保留。
Biblioteka Baidu 1510 #
化学进展
第 18 卷
3 HILIC 特点
3. 1 色谱柱效高, 峰形对称, 保留时间短 早在 HILIC 命 名前, 以硅胶 为色谱 柱的 HILIC
色谱模式就已成功用于碱性药 物及其代谢物 的分 离[ 2,4, 9] 。研究发现, 碱性药物在这种正相硅胶/ 反相 洗脱系统中分离柱效高, 大多数碱性药物色谱峰形 对称性好, 不对称因子小于 1. 2[4, 9, 14, 18, 19] 。碱性药物 在该模式下保留的另一特点是溶质的保留与其亲脂 性无关, 保留因子范围窄, 药物的保留时间短[ 2, 9, 18] 。 另外, 由于流动相中含高浓度有机溶剂/ 低水含量, 色谱柱压降低, 因此可在高流速下以低反压进行分 离, 减少了分析时间[4] 。 3. 2 流动相组成简单, 固定相稳定
2 HILIC 分离机理
硅胶表面含有硅羟基和硅氧烷两种基团, 以及 极少量的金属杂质[ 2, 6, 11] 。由于硅氧烷的存在, 硅胶 具有弱的反相特性。硅羟基以孤单的( single) 、成双 的( germinal) 或相邻的( vicinal) 结合形式存在( 图 1) , 不同的硅羟基具有不同的反应活性和吸附活性。大 部分硅羟基为弱酸性, 极小部分为强酸性, 文献报道 硅胶的 pK a 值在 115 ) 10 的范围内[ 2] 。硅胶的 pK a 值一般是指其表面所有硅羟基 pK a 的平均值, 它并 不一定能反映硅胶表面强酸性点的存在, 尽管这些 表面 浓 度极 低 的强 酸 性点 在色 谱 过 程中 非 常 活 泼[ 2] 。硅胶表面的复杂性使得碱性化合物在 HILIC 模式下 的保留 机理非 常复 杂, 通常为 混合 保留 机 理[ 2,4, 12) 14] , 存在的机理有: 亲水作用、离子交换及反 相保留。这种多形式的保留对调节溶质的分离选择 性非常有用。但由于各种吸附力强弱的不同, 产生 不正常的峰形, 特别是不只一种机理控制溶质的保 留时更是如此。因此在分析碱性化合物时控制所有 的保留机理非常重要, 以使溶质主要以一种机理与 固定相作用。
胶为固定相的传统正相色谱已广泛用于分离多种中 性化合物, 尤其适用于分离异构体[5] 。然而由于极 性大的碱性化合物与固定相作用强, 需要高极性流 动相才能将其从硅胶柱上洗脱[ 6] 。1975 年 Jane[ 7] 首 次采用高浓度、高极性有机溶剂- 水相缓冲液成功地 分离了碱性药物。此后这种采用正相硅胶色谱柱/ 反相洗脱 液的色 谱系统 引起 了人 们的 广泛注 意,
Law 等[ 20] 研究发现, 在高 pH 值( pH= 912) 的水高浓度有机溶剂混合液中, 固定相稳定, 可使用数月 不影响柱效。McKeown 等[16] 也证实在 pH 为 718 的 流动相中, 6 种碱性混合物进样 636 次后色谱柱稳 定, 未发现柱损伤。这主要是因为在高含量有机溶 剂的流动相中硅胶溶解很慢, 在色谱分离过程中可 以接受。
样品制备如固相 萃取( SPE) 、蛋白沉 淀( PP ) 或 液- 液萃取( LLE) 中, 其最后一步常含强有机溶剂( 如 乙腈、异丙醇等) 。这些溶剂太强, 无法直接注入反 相色谱柱, 它们必需蒸干再溶于与反相条件相适的 弱溶剂中。这一费力又费时的步骤可占到样品处理 所需全部时间的 50% , 消除该步骤可极大地提高样 品通量[ 21] 。此外, 若 分析物不稳定且/ 或经不 起蒸 发及再溶, 则在固相萃取、蛋白沉淀或液- 液萃取的 最后一步后直接进样就能得到更低的检出限和更高
通常人们认为硅胶柱用于分析生物样品时不稳 定, 极性的内源性杂质会在柱上强烈保留, 最后导致 柱损坏。这对于使用非极性流动相的经典正相色谱
来说是正确的, 但是研究发现 HILIC 中使用的极性 流动相能将极性的内源性化合物洗掉, 因此不会累 积在色谱柱上, 因而色谱柱稳定[ 4] 。 3. 3 有利于样品制备
第 11 期
李瑞萍等 亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
# 1509 #
1990 年 A lpert [8] 将这种 色谱模 式命名 为亲 水作 用 色谱。
亲 水 作 用 色 谱 ( hydrophilic interaction chromatography, HILIC) 是一种以极性固定相( 如硅胶 或衍生硅胶) 及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水 溶液为流动相的色 谱模式。它 与传统正相色 谱相 似, 流 动相 的 有机 部 分是 弱 溶剂, 水 溶 液是 强 溶 剂[ 8] 。化合物是按亲水性增加的次序流出, 但所用 的溶剂又与反相色谱相似, 采用与水互溶的极性有 机溶剂如乙腈或甲醇; 而不用传统正相色谱中所用 溶剂如正己烷及氯仿, 且水的含量较大, 通常为 5% 或更高。与反相色谱分离碱性药物相比, 该分离模 式具有峰形对称、保留时间短、重现性好及柱寿命长 等优点[ 4, 9] 。最近几年该技术又与质谱联用, 应用于 生物样品中碱性化合物及其代 谢产物的分离 与鉴 定。该分离技术的优点之一就是保留一些用反相色 谱无法简 单保留 的碱 性化合 物[ 4,10] 。随着 人们 对 HILIC 的深入了解, 它 在碱性药物分离中的应 用越 来越受到研究药物代谢、药物开发和组合化学的科 学家们重视, 近几年的研究报道也逐渐增多。本文 介绍了以硅胶为固定相的亲水作用色谱分离碱性药 物的分离机理、特点及在碱性药物分析和药代产物 研究中的应用。
由于 HILIC 利 用被测组 分与 硅羟基 的相互 作 用, 因此不需要加离子对试剂( 如烷基磺酸盐) 的洗 脱液就能对大范围内的碱性药物进行分离, 流动相 组成简单, 一般 为甲醇- 水相缓冲液或乙腈- 水 相缓 冲液, 常用的缓冲液有硝酸铵- 氨水、乙酸铵- 乙酸P甲 酸P三氟乙酸及磷酸盐- 磷酸等[ 4, 9] 。
1 引言
碱性药物的分离一直是色谱界研究的热点。其 原因之一是在日益发展的制药业中, 很多新开发的 药物为强碱性化合物, 其药效和纯度的评价需用色 谱法。为得到碱性药物理想的色谱行为, 人们不断 开发新的色谱填料 及分离模式以 满足其需求。目 前, 以硅胶为基质的各种化学键合填料为固定相的 反相色谱仍占碱性药物分离的主导地位。但由于键 合不完 全, 碱 性化合 物常 与残 留的硅 羟基 发生 作 用[ 1,2] , 致使峰形严重拖尾。而且强极性碱性化合物 的亲水性很强, 在酸性 pH 条件下它们带的 净电荷
第 18 卷 第 11 期 2006 年 11 月
化 学 进展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol. 18 No. 11 Nov. , 2006
亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
李瑞萍1* 黄骏雄2
( 1. 三峡大学 Alan G. MacDiarmid 再生能源研究所 宜昌 443002; 2. 中国科学院生态环境研究中心 环境化学与生态毒理学重点实验室 北京 100085)
收稿: 2006 年 1 月, 收修改稿: 2006 年 5 月 * 通讯联系人 e-mail: amylee0289@ 163. com
使这些化合物用反相色谱很难保留和分离。因此必
须采用二次化学平衡的原理, 利用离子对色谱、离子 抑制或硅羟基掩 蔽剂等, 以保证良好的分 离效果。 但这些洗脱条件降低质谱检测灵敏度, 不能与质谱 兼容[ 3,4] 。以非极性或低极性有机溶剂为流动相、硅
Hydrophilic Interaction Chromatography and Its Applications in the Separation of Basic Drugs
Li Ruiping1* H uang Junxiong 2 ( 1. Alan G. MacDiarmid Research Institute of Renewable Energy, Chinese Three Gorges University, Yichang 443002, China; 2. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco- Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China)
摘 要 亲水作用色谱是采用极性固定相、高含量极性有机溶剂- 水相缓冲液为流动相的一种分离技 术, 它能有效地保留反相色谱中保留弱或不保留的强极性碱性药物。本文综述了以未键合硅胶为固定相的 亲水作用色谱分离碱性药物的机理、特点及其应用的最新进展。
关键词 亲水作用色谱 碱性药物 分离 中图分类号: O657. 7; O657. 63 文献标识码: A 文章编号: 1005- 281X( 2006) 11-1508-06
图 1 硅胶结构中硅羟基的存在形式 Fig. 1 The silanol species present in the silica structure
尽管碱性化合物在硅胶表面的保留机理复杂, 影响因素较多, 但普遍认为存在离子交换机理, 即在 硅胶固定相上, 极性的碱性化合物与带负电荷的硅 羟基进行弱的阳离子交换。Bidlingmeyer 等[ 12] 在普 通硅胶色谱柱上, 系统地研究了离子强度、pH 值、离 子交换容量及溶剂强度对溶质保留的影响, 证实了 碱性化合物在反相洗脱条件下以多种机理在硅胶柱 上保留。在一定 pH 条件下, 溶质的保留值随流动 相中无机盐浓度的增大而减小, 说明存在离子交换 机理。当离子强度一定时, 随着 pH 的增加, 所有离 子型有机胺类药物的保留逐渐增大, 当 pH 接近有 机碱 pK a 值时保留达到最大, 随后又降低。他们还 观察到, 当保持 pH 值和离子强度恒定时, 溶剂组成 与容量因子 kc之间成线性关系, 与典型的反相系统 类似。硅胶极 性弱 于反 相洗 脱剂, 硅氧 烷是 疏水 的[ 2] , 因此在高 pH 值的亲水作用色谱系统中, 碱性 药物的解离部分和未解离部分分别与硅胶表面亲水 性的 SiO- 和疏水性的硅氧烷作用。最近作者[ 14] 及 其他一些学者[ 15, 16] 也证实了 HILIC 模式下碱性化合 物在硅胶柱上类似的复杂保留机理。
Abstract Hydrophilic interaction chromatography ( HILIC) is a convenient method for separating basic drugs and their metabolites which have poor retent ion on reversed- phase column by passing highly polar organic- aqueous buffer mobile phase across a polar stationary phase. The mechanism and characterization of HILIC using silica columnPreversedphase elution system are described. In addition, the recent progress of its applications in the separation of basic pharmaceuticals is reviewed.
根据离子交换理论, 保留值 kc是溶质 pK a 值的 函数, 则保留受溶质 pK a 值的影响。Law[17] 采用 pH = 912 的甲醇- 乙酸铵缓冲液( 9B1) 为流动相, 研究了 69 种有机胺类药物的 pK a 值与保留之间的关系, 证 实 logkc与 pK a 值之间具有良好的线性相关性, 使离 子交换理论得到 了很好验证, 同时还发 现 log kc与 pK a 值之间的相关性受碱性中心或其附近取代基的 影响。Cox 等[ 13] 通过研究认为碱性化合物在硅胶柱 上的保留机理与其在色谱条件下所呈的状态有关, 呈离子型的有机胺类药物主要以阳离子交换作用保 留, 而非离子的则主要以疏水作用保留。
Biblioteka Baidu 1510 #
化学进展
第 18 卷
3 HILIC 特点
3. 1 色谱柱效高, 峰形对称, 保留时间短 早在 HILIC 命 名前, 以硅胶 为色谱 柱的 HILIC
色谱模式就已成功用于碱性药 物及其代谢物 的分 离[ 2,4, 9] 。研究发现, 碱性药物在这种正相硅胶/ 反相 洗脱系统中分离柱效高, 大多数碱性药物色谱峰形 对称性好, 不对称因子小于 1. 2[4, 9, 14, 18, 19] 。碱性药物 在该模式下保留的另一特点是溶质的保留与其亲脂 性无关, 保留因子范围窄, 药物的保留时间短[ 2, 9, 18] 。 另外, 由于流动相中含高浓度有机溶剂/ 低水含量, 色谱柱压降低, 因此可在高流速下以低反压进行分 离, 减少了分析时间[4] 。 3. 2 流动相组成简单, 固定相稳定
2 HILIC 分离机理
硅胶表面含有硅羟基和硅氧烷两种基团, 以及 极少量的金属杂质[ 2, 6, 11] 。由于硅氧烷的存在, 硅胶 具有弱的反相特性。硅羟基以孤单的( single) 、成双 的( germinal) 或相邻的( vicinal) 结合形式存在( 图 1) , 不同的硅羟基具有不同的反应活性和吸附活性。大 部分硅羟基为弱酸性, 极小部分为强酸性, 文献报道 硅胶的 pK a 值在 115 ) 10 的范围内[ 2] 。硅胶的 pK a 值一般是指其表面所有硅羟基 pK a 的平均值, 它并 不一定能反映硅胶表面强酸性点的存在, 尽管这些 表面 浓 度极 低 的强 酸 性点 在色 谱 过 程中 非 常 活 泼[ 2] 。硅胶表面的复杂性使得碱性化合物在 HILIC 模式下 的保留 机理非 常复 杂, 通常为 混合 保留 机 理[ 2,4, 12) 14] , 存在的机理有: 亲水作用、离子交换及反 相保留。这种多形式的保留对调节溶质的分离选择 性非常有用。但由于各种吸附力强弱的不同, 产生 不正常的峰形, 特别是不只一种机理控制溶质的保 留时更是如此。因此在分析碱性化合物时控制所有 的保留机理非常重要, 以使溶质主要以一种机理与 固定相作用。
胶为固定相的传统正相色谱已广泛用于分离多种中 性化合物, 尤其适用于分离异构体[5] 。然而由于极 性大的碱性化合物与固定相作用强, 需要高极性流 动相才能将其从硅胶柱上洗脱[ 6] 。1975 年 Jane[ 7] 首 次采用高浓度、高极性有机溶剂- 水相缓冲液成功地 分离了碱性药物。此后这种采用正相硅胶色谱柱/ 反相洗脱 液的色 谱系统 引起 了人 们的 广泛注 意,
Law 等[ 20] 研究发现, 在高 pH 值( pH= 912) 的水高浓度有机溶剂混合液中, 固定相稳定, 可使用数月 不影响柱效。McKeown 等[16] 也证实在 pH 为 718 的 流动相中, 6 种碱性混合物进样 636 次后色谱柱稳 定, 未发现柱损伤。这主要是因为在高含量有机溶 剂的流动相中硅胶溶解很慢, 在色谱分离过程中可 以接受。
样品制备如固相 萃取( SPE) 、蛋白沉 淀( PP ) 或 液- 液萃取( LLE) 中, 其最后一步常含强有机溶剂( 如 乙腈、异丙醇等) 。这些溶剂太强, 无法直接注入反 相色谱柱, 它们必需蒸干再溶于与反相条件相适的 弱溶剂中。这一费力又费时的步骤可占到样品处理 所需全部时间的 50% , 消除该步骤可极大地提高样 品通量[ 21] 。此外, 若 分析物不稳定且/ 或经不 起蒸 发及再溶, 则在固相萃取、蛋白沉淀或液- 液萃取的 最后一步后直接进样就能得到更低的检出限和更高
通常人们认为硅胶柱用于分析生物样品时不稳 定, 极性的内源性杂质会在柱上强烈保留, 最后导致 柱损坏。这对于使用非极性流动相的经典正相色谱
来说是正确的, 但是研究发现 HILIC 中使用的极性 流动相能将极性的内源性化合物洗掉, 因此不会累 积在色谱柱上, 因而色谱柱稳定[ 4] 。 3. 3 有利于样品制备
第 11 期
李瑞萍等 亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
# 1509 #
1990 年 A lpert [8] 将这种 色谱模 式命名 为亲 水作 用 色谱。
亲 水 作 用 色 谱 ( hydrophilic interaction chromatography, HILIC) 是一种以极性固定相( 如硅胶 或衍生硅胶) 及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水 溶液为流动相的色 谱模式。它 与传统正相色 谱相 似, 流 动相 的 有机 部 分是 弱 溶剂, 水 溶 液是 强 溶 剂[ 8] 。化合物是按亲水性增加的次序流出, 但所用 的溶剂又与反相色谱相似, 采用与水互溶的极性有 机溶剂如乙腈或甲醇; 而不用传统正相色谱中所用 溶剂如正己烷及氯仿, 且水的含量较大, 通常为 5% 或更高。与反相色谱分离碱性药物相比, 该分离模 式具有峰形对称、保留时间短、重现性好及柱寿命长 等优点[ 4, 9] 。最近几年该技术又与质谱联用, 应用于 生物样品中碱性化合物及其代 谢产物的分离 与鉴 定。该分离技术的优点之一就是保留一些用反相色 谱无法简 单保留 的碱 性化合 物[ 4,10] 。随着 人们 对 HILIC 的深入了解, 它 在碱性药物分离中的应 用越 来越受到研究药物代谢、药物开发和组合化学的科 学家们重视, 近几年的研究报道也逐渐增多。本文 介绍了以硅胶为固定相的亲水作用色谱分离碱性药 物的分离机理、特点及在碱性药物分析和药代产物 研究中的应用。
由于 HILIC 利 用被测组 分与 硅羟基 的相互 作 用, 因此不需要加离子对试剂( 如烷基磺酸盐) 的洗 脱液就能对大范围内的碱性药物进行分离, 流动相 组成简单, 一般 为甲醇- 水相缓冲液或乙腈- 水 相缓 冲液, 常用的缓冲液有硝酸铵- 氨水、乙酸铵- 乙酸P甲 酸P三氟乙酸及磷酸盐- 磷酸等[ 4, 9] 。