实验4 氨基酸类物质的荧光光谱分析

氨基酸类物质的荧光光谱分析

【摘要】

荧光物质吸收特定频率辐射能量后会产生荧光，不同荧光物质的最大吸收波长、最大激发波长以及荧光谱图不同，以此可以鉴定未知物质。荧光还与物质浓度在一定范围内有线性关系，可以通过测定未知浓度的已知物荧光吸收强度来测定浓度。

【实验目的】

1、熟悉荧光分析法的基本原理；

2、了解RF–5301 型荧光分光光度计的构造、原理，掌握荧光分析法的基本操作；

3、掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。

【基本原理】

原理概述：利用荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后，由基态跃迁至激发态的任一振动能级，在溶液中以热的形式损失部分能量后回到第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射形式去活化跃迁到电

子基态的任一振动能级，便产生荧光。

荧光的产生：荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，

而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子

基态的任一振动能级，便产生荧光。能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π 键结构

或具有刚性平面结构等特征。

发射光谱与吸收光谱：

荧光分析法的特点：

优点：灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽，能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量 子产率、荧光偏振等诸多信息；

缺点：由于能够产生强荧光的物质相对较少，荧光分析法的应用不太广泛；

改进：对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。

氨基酸：含有氨基和羧基的一类有机化合物，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有能发

射荧光的组分，可以用荧光法测定。

【仪器与试剂】

1、仪器：F-4600 型荧光分光光度计，10 mL 带玻璃塞的比色管10 只，移液管

图1荧光光谱仪结构示意图

2、试剂：标准溶液a：4×10-4mg/mL的酪氨酸溶液；

标准溶液b：1×10-3mg/mL的苯丙氨酸溶液；

标准溶液c：1×10-3mg/mL的色氨酸溶液；

色氨酸待测样；

去离子水。

【实验步骤】

1、配制实验样品：

（1）分别移取标准溶液a、标准溶液b 和色氨酸待测样于10 mL 比色管中，待用。

（2）分别移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL标准溶液c于7个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。

2、仪器操作：

（1）打开计算机和分光光度计主机，双击分光光度计图标“FL-Solutions”,等系统自检结束。预热15-30分钟待仪器稳定后方可使用。

（2）选择光谱测量界面（“Method”—“General”—“Measurement”—“Wavelength scan”），绘制上述步骤（1）中各溶液的激发光谱和发射光谱，并确定各自的λEmmax和λExmax。

（3）选择定量测定界面（“Method”--“General”--“Measurement”--“photometry”），依据上述步骤中测得的酪

氨酸的λEmmax 和λExmax ，设定定量测定的参数，测定系列标准溶液的荧光强度Is 值，然后在相同条件下测量未知样的相对荧光强度I x ，并记录实验数据。

【数据处理与实验结果分析】

1、 色氨酸的荧光分析：

调整狭缝宽度至最佳值：d ex =5.0nm ，d em =5.0nm 。首先预扫。 取 λEm =350nm

图2 色氨酸激发光谱

选择最大强度对应的波长约 220nm 处，得到色氨酸的发射光谱：

0500

1000

1500

2000

2500

3000

荧光强度

波长 (nm)

5001000

1500

2000

2500

荧光强度

波长 (nm)

图3 色氨酸发射光谱

由色氨酸的发射光谱可以看到，色氨酸的最大发射波长在348nm 左右。

2、 酪氨酸的荧光分析：

取 λEm =301nm

图4 酪氨酸激发光谱

选择最大强度对应的波长约 225nm 处，得到酪氨酸的发射光谱：

图5 酪氨酸发射光谱

由酪氨酸的发射光谱可以看到，酪氨酸的最大发射波长在303nm 左右。

1000

200030004000500060007000荧光强度

波长 (nm)

240

260280300

320340360380400420

-1000

01000

2000300040005000

60007000荧光强度

波长 (nm)

3、 苯丙氨酸的荧光分析：

取 λEm =383nm ，得到激发光谱如图 4：

图6 苯丙氨酸激发光谱

选择最大强度对应的波长约 208nm 处，得到苯丙氨酸的发射光谱：

图7 苯丙氨酸发射光谱

由苯丙氨酸的发射光谱可以看到，苯丙氨酸的最大发射波长在283nm 左右。

500

1000

1500

2000

2500

荧光强度

波长 (nm)

240

260

280

300

320

340

360

0500

1000

1500

2000

2500

荧光强度

波长 (nm)