基因检测技术比较ppt课件
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5
1. Illumina
(1)DNA待测 文库
构建
(2)Flowcell (3)桥式PCR 扩增
与变性
6
7
2. Roche 454
(1)DNA文库 制备 (2) Emulsion PCR (3)焦磷酸测 序
8
9
第三代测序 技术
以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测 序技术，被称之为第三代测序技术。
18
FRET技术
原理：探针由两条和模版互补、且相邻的特异探
针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧
光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光
基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团
和受体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被
Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640
13
九、基因芯片检测原理及
T7 promoter
PCR T7 promoter
简要过程
体内转录
荧光素
片段化
1.5 小时
ACGT
杂交、冲洗
扫描分析 1 小时
图 2 样品处理与检测过程简图 14
三 实时定量 PCR技术
由于染料不能区分特异性PCR产物和引 物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探 针，所以检测的特异性始终不如后来出现的 探针法；也不能做多重PCR检测 （Multiplex）。
12
二 基因芯片 技术
基因芯片的测序原理是杂交测序方法， 即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进 行核酸序列测定的方法，在一块基片表面 固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶 液中带有荧光标记的核酸序列，与基因芯 片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时， 通过确定荧光强度最强的探针位置，获得 一组序列完全互补的探针序列。据此可重 组出靶核酸的序列。
发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基
Hale Waihona Puke Baidu
团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检
测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格
对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和
SNP检测。两个单标记探针的长短不影响信号的传递，
而探针间的距离通常为1-5bp。
19
分子信标技 术
基因SNP检测技术 比较
吴鹏超 遗传与健康产 品线
1
基因多态性检测技 术：
一 DNA测序技术（DNA sequence） 二 基因芯片（gene microarray） 技术
三 实时定量PCR（Real time PCR， RT-PCR）技术
2
一 DNA测 序技术
从1977年第一代DNA测序技术 （Sanger法），发展至今三十多年时 间，测序技术已取得了相当大的发展， 从第一代到第三代乃至第四代，测序 读长从长到短，再从短到长。下面我 们就一一介绍前三代测序技术。
21
3
第一代测序 技术
Sanger法核
心原理是：
由于ddNTP
的2’和3’都不
含羟基，其
在DNA的合
成过程中不
能形成磷酸
二酯键，因
此可以用来
中断DNA合
4
成反应。
第二代测序 技术
第一代测序技术的主要特点是测序读 长可达1000bp，但其测序成本高，通量 低严重影响了真正大规模的应用。而经 过不断的技术开发和改进，以Roche公 司的454技术、illumina公司的Solexa， Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记 的第二代测序技术诞生了。
分子信标（ Molecular beacon，MB）是 一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针， 两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端 的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧 靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭 剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不 是可见光形式释放出来。
20
Thanks!
15
TaqMan 技术
Specific Target Amplification
Allele-Specific Genotyping
(if necessary)
Reaction
Fwd
Y
Rev
Fwd
Y
Rev
TaqMan Probes
T
C
TaqMan 技术
1. Probe hybridization
10
PacBio SMRT 技术
基本原理：
DNA聚合酶和
模板结合,4色荧
光标记 4 种碱
基（即是
dNTP）,在碱基
配对阶段,不同
碱基的加入,会
发出不同光,根
据光的波长与峰
值可判断进入的
11
碱基类型。
Oxford Nanopore Technologies
当DNA碱基通过 纳米孔时，它们 使电荷发生变化， 从而短暂地影响 流过纳米孔的电 流强度，灵敏的 电子设备检测到 这些变化从而鉴 定所通过的碱基。
3. Probe displacement & cleavage
T
T
Y
Y
T Y
2. Target amplification
4. PCR & cleavage products
MGB技术
原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，3' 端采用了非荧光性的淬灭基因，大大降低了本底信号 的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环 化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交, 而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬 灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个 15bp的MGB 探针的信噪比大于6,优于理想状态下的 25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。允许 采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。
1. Illumina
(1)DNA待测 文库
构建
(2)Flowcell (3)桥式PCR 扩增
与变性
6
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2. Roche 454
(1)DNA文库 制备 (2) Emulsion PCR (3)焦磷酸测 序
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9
第三代测序 技术
以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测 序技术，被称之为第三代测序技术。
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FRET技术
原理：探针由两条和模版互补、且相邻的特异探
针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧
光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光
基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团
和受体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被
Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640
13
九、基因芯片检测原理及
T7 promoter
PCR T7 promoter
简要过程
体内转录
荧光素
片段化
1.5 小时
ACGT
杂交、冲洗
扫描分析 1 小时
图 2 样品处理与检测过程简图 14
三 实时定量 PCR技术
由于染料不能区分特异性PCR产物和引 物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探 针，所以检测的特异性始终不如后来出现的 探针法；也不能做多重PCR检测 （Multiplex）。
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二 基因芯片 技术
基因芯片的测序原理是杂交测序方法， 即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进 行核酸序列测定的方法，在一块基片表面 固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶 液中带有荧光标记的核酸序列，与基因芯 片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时， 通过确定荧光强度最强的探针位置，获得 一组序列完全互补的探针序列。据此可重 组出靶核酸的序列。
发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基
Hale Waihona Puke Baidu
团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检
测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格
对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和
SNP检测。两个单标记探针的长短不影响信号的传递，
而探针间的距离通常为1-5bp。
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分子信标技 术
基因SNP检测技术 比较
吴鹏超 遗传与健康产 品线
1
基因多态性检测技 术：
一 DNA测序技术（DNA sequence） 二 基因芯片（gene microarray） 技术
三 实时定量PCR（Real time PCR， RT-PCR）技术
2
一 DNA测 序技术
从1977年第一代DNA测序技术 （Sanger法），发展至今三十多年时 间，测序技术已取得了相当大的发展， 从第一代到第三代乃至第四代，测序 读长从长到短，再从短到长。下面我 们就一一介绍前三代测序技术。
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第一代测序 技术
Sanger法核
心原理是：
由于ddNTP
的2’和3’都不
含羟基，其
在DNA的合
成过程中不
能形成磷酸
二酯键，因
此可以用来
中断DNA合
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成反应。
第二代测序 技术
第一代测序技术的主要特点是测序读 长可达1000bp，但其测序成本高，通量 低严重影响了真正大规模的应用。而经 过不断的技术开发和改进，以Roche公 司的454技术、illumina公司的Solexa， Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记 的第二代测序技术诞生了。
分子信标（ Molecular beacon，MB）是 一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针， 两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端 的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧 靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭 剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不 是可见光形式释放出来。
20
Thanks!
15
TaqMan 技术
Specific Target Amplification
Allele-Specific Genotyping
(if necessary)
Reaction
Fwd
Y
Rev
Fwd
Y
Rev
TaqMan Probes
T
C
TaqMan 技术
1. Probe hybridization
10
PacBio SMRT 技术
基本原理：
DNA聚合酶和
模板结合,4色荧
光标记 4 种碱
基（即是
dNTP）,在碱基
配对阶段,不同
碱基的加入,会
发出不同光,根
据光的波长与峰
值可判断进入的
11
碱基类型。
Oxford Nanopore Technologies
当DNA碱基通过 纳米孔时，它们 使电荷发生变化， 从而短暂地影响 流过纳米孔的电 流强度，灵敏的 电子设备检测到 这些变化从而鉴 定所通过的碱基。
3. Probe displacement & cleavage
T
T
Y
Y
T Y
2. Target amplification
4. PCR & cleavage products
MGB技术
原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，3' 端采用了非荧光性的淬灭基因，大大降低了本底信号 的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环 化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交, 而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬 灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个 15bp的MGB 探针的信噪比大于6,优于理想状态下的 25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。允许 采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。