关于蔗糖酶活性的研究 生物化学实验

对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究

兰德新（同组：李建鑫）

浙江工业大学海洋学院食工1201

摘要：

目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。

关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE

文献综述:

蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。

而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性

测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。通过基因工程手段调节植物光合产物和代谢产物的分配是当今研究的热点。植物中蔗糖酶的研究正向分子水平方向发展，无论是其分子结构和作用机理，还是基因表达和调控，都为应用基因工程调节光合产物及代谢组分奠定了基础。

对于蔗糖酶的研究，还有很多有待解决的问题：植物蔗糖酶同工酶的种类比较多，其在植物中的特定作用还不甚清楚；蔗糖酶与蔗糖含量有时并不相关，尽管一些转基因植株检测表明其蔗糖酶活性大大降低，但蔗糖水平却与对照差不多；应用基因工程技术抑制蔗糖酶的活力在一些转基因植株的发育过程中也不一致；是否还有其他的代谢产物或物质调控蔗糖酶的表达等。

因此关于蔗糖酶的研究还有待进一步深入，需要把生理、生化以及分子生物技术有机结合在一起，对于这些问题的最终解决将有助于更好地理解蔗糖酶在植物中的生理作用。

实验1. 蔗糖酶的提取及初步提纯

1.1材料与方法

1.1.1试剂

①新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；

②醋酸钠（AR）；

③甲苯（AR）；

④4mol/L醋酸；

⑤95%乙醇（<-20℃）；

⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml

的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。

⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3

缓冲液稀释10倍即得。

注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。

1.1.2器材

①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；

②量筒10ml（×1）25ml（×1）;

③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；

④具塞试管10 ml（×3）；

⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；

⑥培养箱；

⑦恒温水浴箱；

⑧磁力搅拌器，搅拌子；

⑨高速冷冻离心机。

1.1.3操作方法

1．酵母的自溶

在250ml锥形瓶中加入冰冻的啤酒酵母20g、醋酸钠 1.6g，搅拌15~20min，使团块的鲜酵母液化，加1.5ml甲苯用大小合适的软木塞将瓶

口塞住，摇动10min使甲苯和酵母液充分混匀，放入37℃培养箱中保温

60h，使酵母自溶。

因本实验采用的是啤酒酵母，故酵母自溶时散发着浓烈的酒香。经自溶后，酵母液得到颜色加深。

2．初提取液A

在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，加10ml蒸馏水，摇匀，倒入塑料离心管中，平衡（分给同学酵母液少许少许）后用高速冷冻离心机

4℃、15000r/min离心10min。经离心一次后，离心管中的悬液分两层，

上层为黄褐色浆状液体，下层为固体，呈斜面状。取上层液体后再次离心，

再取上层液体记体积为VA=19.3ml。取3ml保存，用于后续实验，所提取

的液体为初提液A。

3．热提取液B

将初提液A倒入50ml锥形瓶中，加入3.2ml4mol/L的HAc，变为悬浊液，摇匀后入50℃水浴中20min。溶液的颜色变浅，呈乳白色。迅速放入冰块

中冷却，倒入离心管中，离心，取得上清液，为淡黄色澄清液体，得

VB=19.5ml。取3ml保存，用于后续实验。

4．乙醇沉淀提取液C

将热提取液B 倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加（-20℃）95%的等体积冰乙醇，30min后继续搅拌5min，烧杯底部产生

白色固体，取液体，离心，保留离心管中的固体，用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得

Vc=5.6ml。

1.2结果与讨论

VA总=VA=19.3ml

VB总=VB·[VA/(VA-3)]=23.1ml

VC总=Vc·[VA/(VA-3)] ·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=7.84ml。

酵母菌自溶的时间超过60h不可太多，否则可能使蛋白酶进一步自溶，酶量减少。

也可以用其他酵母品种。如酵母粉（超市有售），可使采购原料、实验操作更为简便。

50℃下，除了蔗糖酶，可能有其他酶未完全失活，仍留在上清液中。

用乙醇沉淀蔗糖酶时，添加过程中乙醇温度会回升，达不到要求的-20℃，或者可能有其他与蔗糖酶在乙醇中行为相似的酶，造成误差。

1.3结论

VA总=19.3ml

VB总=23.1ml

VC总=7.84ml。