第五章 环境毒理学常用实验方法

剂量定期递增染毒法
（二）20天蓄积试验法
（三）生物半减期法
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一、试验方法
（一）蓄积系数法（cumulative coefficient method）
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医学上的动物实验
各种医学杂志上大量的实验报告所采用的动物 实验的方法有：加速、攻击、窒息、致盲、烧灼、 离心、挤压、震荡、拥挤、砸碎、药物试验、实 验性神经症 、冷冻、加热、出血、击打后腿、 制动、隔离、复合伤、捕杀、蛋白质缺乏、惩罚、 照射、饥饿、休克、脊髓损伤、应激或压力和干 渴，还有很多。
第五章
环境毒理学常用实验方法
回顾
• 第一节、环境污染物的毒作用
– 基本概念：毒物，毒性，中毒，危险性和危害性，剂 量，效应和反应，剂量-效应和反应关系（掌握） – 剂量：绝对致死量（LD100），半数致死量（LD50），最 小致死量（MLD），最大耐受量（MTD）、半数效应剂 量（ED50）、最小有作用剂量、最大无作用剂量（掌握） – 毒作用类型（了解） – 联合作用（掌握） – 生物毒素：黄花菜，蘑菇（了解）
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残酷的动物实验
动物实验
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动物实验目的
1 科学研究： 探测未知，发现新知识。 2 常规检测：药品、化妆品和家居用品 的毒性。
3 教学实验：验证知识，练习操作。
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1 科学研究
动物主要用于生物医学和心理学的实验，如疾 病的认知和模型，药物的作用和毒性，新的医疗 或手术开发。 动物实验为现代医学的发展做出了很大贡献， 因此而牺牲的动物数量和造成的动物痛苦也是无 法估量的。如今科学研究不仅成为攫取名利和谋 生的工具，大量的研究和动物实验又是微不足道 或者毫无意义的，甚至有些研究设计就不是为了 产生重要的有益结果，动物也成为无谓的牺牲品。 所以，大量的动物的遭受折磨和痛苦是完全不必 要的。
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蓄积毒性实验
蓄积毒性作用
• 环境污染物在体内的蓄积作用，是引起亚慢性 和慢性毒性作用的基础。 • 常是评估环境污染物毒性作用的指标之一；
• 制定其在环境中的卫生标准的重要参考依据。
• 阐明污染物有无蓄积作用及其程度有重要意义。
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蓄积毒性实验
一、试验方法 （一）蓄积系数法
固定剂量每天连续染毒法
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• 静式吸入染毒
在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物，造成含一 定浓度受试物的空气环境，使受试动物在规定时间内, 经吸入而达到染毒，适用于短时间染毒的试验。 • 动式吸入染毒
采用机械通风为动力，连续不断地将含有已知浓度受 试物的新鲜空气送入染毒柜内，并排出等量的污染气 体，使染毒浓度保持相对稳定，这样可使染毒时间不 受染毒柜(室)容积的限制，也可避免动物缺氧、CO2积 聚、温度增加等对试验结果的可能影响，适用于较长 时间以及反复染毒的试验使用。
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动物有感情吗？
• 动物和我们一样也很重感情，它们也能 感受到爱、恐惧、伤心和愤怒。所有的 动物都是有感情的，只是他们的表达方 式不太一样。要不人为什么老说。人是 最最懂感情的动物？
• 请举例说明身边动物有感情的例子？
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感人一幕
村里两只白鸭结 伴出行，不想其 中一只被车轧死， 另外一只白鸭守 在同伴尸体一旁 30分钟，无论谁 想上前，它都准 备去叨人，不许 生人靠近。
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二、急性毒性试验的目的
探求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能 毒害的危险性；
求该化学物的剂量-反应关系，为其它毒性实验打下 选择染毒剂量的基础。
表示急性毒性大小：LD50
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三、急性毒性试验的内容
（1）急性毒性测定 确定一次染毒的 LD50或LC50； （2）经皮肤染毒实验 考察受检化学物质能否经皮肤进入体内，LD50； （3）局部作用实验 通过使受检化学物质直接接触皮肤及眼结膜等试验，
研究其对生物体局部有无刺激、腐蚀及其他危害作用。
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（4）中毒症状的观察 据染毒动物症状及体征，粗略了解毒物作用的程度和 可能作用部位。 （5）功能及病理组织学检查 选择必要的功能指标，寻求毒作用剂量与功能改变 的关系，确定急性阈剂量； 通过病理组织学检查，进一步了解毒作用部位及毒 害程度。
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第二节、蓄积毒性实验
• 慢性中毒损害实质性脏器的毒物——小鼠(实质性脏器容易罹患病
变)
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实验动物的选择
个体选择
• 年龄
•
除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者。 性别
根据目的，若对动物性别无特殊要求，宜选用雌雄各半。 • 生理状态——怀孕、哺乳 通常实验均不宜采用处于特殊生理状态的动物进行，为了 某种特定的实验目的除外。 • 健康状况 所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上， 以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。
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图 8-3 动式染毒柜装置示意图
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（3）经皮肤染毒
液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮 肤的机会。 能经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式 经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间 质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物 主要通过这种途径渗透入皮肤，角质层薄的 皮肤部位更易吸收。
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• 实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹 等异常现象，剔除不合格动物。 • 染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量。 • 接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿。 • 成年动物——年老动物表皮厚度、细胞成分改变 • 为保证不因皮肤部位不同而形成的化学物渗透率差异，
兔眼刺激试验 Draize test
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3 教学
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全世界每年用多少实验动物？ 难以准确估计
英国废除活体解剖联盟(BUAV)估计： 脊椎动物约为1亿，欧盟1000~1100万。
纳菲尔德生命伦理委员会估计：全世界约 为5000万~1亿。
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美国每年用多少实验动物？
• 2005年农业部统计共计为120万，但不包括 大鼠和小鼠。后者是大头，约占90%。 • 1995年塔夫茨大学研究： 1992年总共用实验动物1400~2200万。1970 年为5000万。 • 1986年，美国国会技术评估委员会报告： 每年1000万~1亿，最佳估计值至少在 1700~2200万。
一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤。面积则依据选
用动物及受试物的剂量和剂型而定。（如家兔可取 5cm×6cm 、豚鼠取 3cm×4cm 、大鼠取 1.5cm ～ 2.0cm
Fra Baidu bibliotek
直径的面积，小鼠取1.0cm～1.5cm直径的面积。）
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（4）其它途径染毒
有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究，或进行一 些必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救 药物筛选等)，往往用注射途径染毒。 静脉注射:大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉 注射途径 肌肉注射 皮下注射 腹腔注射:小动物
城市晚报（长春），2013年08月21日
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黄狗撩水救鱼：鼻子舀水泼向奄奄 一息的鱼身上
15年4月22日，北京女孩诸柔萌(音) 在微博 上晒与170斤宠物猪同吃同眠
狗的报恩！女子公园遇4歹徒 流浪犬 救她一命
第一节 急性毒性试验
一、急性毒性的概念 急性毒性是指机体(人或实验动物)一次或24h之内多 次接触(染毒)外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效 应，包括引起死亡效应。 一次：瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但 在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持 续地接触化学物的过程，“一次”含有时间因素。 多次：当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机 体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在24h内 分次染毒。
借助已有毒理学研究资料选择。
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实验动物的选择
借助已有毒理学研究资料选择
• 气体、蒸气对粘膜的刺激作用——猫
• 毒物对皮肤的局部作用——豚鼠或兔(皮肤对刺激物的反应近似于人) • 过敏性反应——豚鼠(易于致敏) • 观察致呕吐作用的实验研究——狗、猫 • 外界环境因素引起机体体温过高及体温过低的反应——兔或 猫(大鼠、小鼠对于体温调节不稳定) • 高血压病理——狗、兔、大鼠(易出现血压变化) • 物质的致癌作用——小鼠和大鼠
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动物模型选择的依据：
动物模型对于一定环境因子的反应尽可能与目标生物的反应 相近;
具有经济可行性。
实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性 的不确定性
实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存 在着质的差别 高剂量向低剂量外推的不确定性 小数量实验动物到大量人群外推的不确定性
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③吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到 动物的舌后咽部迫使其咽下。 此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭 的化学物。
兔、猫及狗等较大动物可用此法。
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（2）经呼吸道染毒
凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的 可能，在生产过程中形成气溶胶的化学物也可经呼吸 道吸入。 类型: 动物自行吸收 静式吸入染毒 动式吸入染毒 人工动物气管注入 人工动物气管注入 —— 将液态或固态外源化学物注入 肺内。这是一个手术过程，仅适用于制造化学物对肺 脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究。
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(1) 经口染毒 优缺点
优点：接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水 的方式，方法简便、易操作。 缺点 进食时浪费、损失饲料多，摄入的量不准确； 如果化学物有异味，动物可能拒食； 如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可 以水解，则剂量也不准确； 有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能；
更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。
• 第二节、影响毒作用因素
– 毒物因素、机体因素、环境因素、接触条件（掌握）
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Outline
• 实验基础
• 急性毒性实验 • 蓄积性毒性实验 • 亚慢性和慢性毒性实验
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环境毒理学
实验基础
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实验动物的选择
•
实验动物 经人工培育，对其携带微生物实行控制， 遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研 究的动物。
引自彼得·辛格《动物解放》
的确方法“还有很多” „ 例如实验感染和 中毒就是另外最常见的二大类。
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动物实验的残酷性在于， 不仅动物几乎全都被处死， 而且造成很多动物极为严重 乃至难以忍受的躯体和精神 上的急性或慢性折磨和痛苦。
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颅内插管→
后肢砸伤↘
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癌肿→
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2 检试刺激性

温血动物
• •
兔、豚鼠、大鼠、小鼠
有时也用猴、狗、猫等
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小鼠
大鼠
豚鼠
家兔
仓鼠
实验动物的选择
种属的选择 个体选择
年龄
体重
性别
生理状态
健康状况
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实验动物的选择
种属的选择
•
•
机体反应上尽量近似于人体；
易获得、易饲养、易管理；
•
• •
最敏感、最合适；
选用几种不同种属的动物(对毒作用不清楚的化学物质)；
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2005年欧洲使用的实验动物的构成（共计 1210万）
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我国的动物实验的问题
1 科研经费增长，晋升制度缺陷，论文数量居世界 前列，动物实验大量增加。 2 大量招收学位研究生，博士培养数量已跃居世界 第一。生物医学的研究生大都依靠动物实验完成 学位论文。 3 粗放。数量大，但有科学意义的少，无意义的重 复多，创新极其罕见。 4 缺乏任何实质性的审查监督的手续、组织和制度。 5 “与动物实验密切相关的不仅有论文发表和职务 晋升，而且还能获奖和得到新项目的经费。”
蓄积毒性作用
– 低于中毒阈剂量的外来化合物，反复 多次地与机体持续接触，经一定时间 后使机体出现明显的中毒表现。
– 进入速度>机体消除速度—不断累 积—毒性作用阈剂量
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蓄积毒性实验
蓄积毒性作用 环境污染物在体内的蓄积作用的过程，表现为： • 物质蓄积：污染物不断进入机体，其吸收量>排出量，以 致在体内的贮留量增多； • 功能蓄积：不断进入机体内的环境污染物，反复作用机体， 引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后 导致出现损害作用。 • 相对的区分，同时存在，互为基础
成年健康动物向年老体弱及患病个体外推的不确定性
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常用染毒途径和方式
（1）经口 灌胃、喂饲、吞咽胶囊 （2）经呼吸道 动物自行吸收（静式吸入染毒、 动式吸入染毒） 人工动物气管注入
（3）经皮肤
（4）其它途径 注射途径
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常用染毒途径和方式
(1) 经口染毒 ① 灌胃 用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内； 直接灌入胃内，不与口腔及食道接触； 给予的化学物剂量准确。 ② 喂饲 将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自 行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水再 推算动物实际摄入化学物的剂量。