第八章 酶的非水相催化

– 对酶活性的影响——溶剂极性与酶活力的关系 – 溶剂对底物和产物分配的影响
• 酶的“必需水”层是底物、产物分布的中介
• 有机溶剂能改变酶分子“必需水”层中底物或产物 的浓度
– 有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入“必需 水”层
– 有机溶剂极性强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶 解度太低
– 20 世纪初，Bourquelot 等人将乙醇、丙酮等有机溶剂 加入到酶的水溶液中，发现当含水量很高时，酶仍具 有一定催化活力，但比水相中低很多 – 1936 年，Sym（波兰）报道了酯酶在有机溶剂中的催 化作用，但一直存在争议，未能引起科学界的重视
• 人类认识的进步 – Sym E. A., Biochemical Journal, 1936, 30: 609-617
– 有机溶剂中酶分子存在形式
• 固态酶：以固体形式存在于有机相中
– 冷冻干燥的酶粉 – 固定化酶 – 结晶酶 —— 今后的热点
• 可溶解酶
– – – – 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子/酶复合物 表面活性剂/酶复合物 微乳液中的酶
常见有机介质反应体系
– 微水介质体系（micro-aqueous media system）
气相介质中的酶催化
酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或 者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的 密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液 中的催化作用有明显的不同特点。
超临界介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指 温度和压力超过某物质超临界点的流体。
– 有机溶剂中键合到酶上的水量与在空气中键合到酶上的水量非常 相似，表明有机溶剂没有直接影响水与酶紧密结合
• Aw 值较大
– 有机溶剂使酶结合的水量减少（溶剂与键合位点的水分子发生直 接竞争）
• 有机溶剂对酶催化反应的影响
– 有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用，直 接或间接影响酶的活性和稳定性
• 化学键选择性
– 键选择性（chemoselectivity），即同一个底物分子 中有两种以上化学键可与酶反应，酶对其中一种优先 反应 – 键选择性的意义：可在不需要基团保护的情况下对特 定部位的基团进行衍生化
• 热稳定性
– 许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中 的好 – 部分酶在有机介质中能耐受高热 – 有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有 关
• 酶分子与溶剂的直接接触，其表面结构发生不可忽视的变化 • 例：枯草杆菌蛋白酶在乙腈中，有 12 个乙腈分子结合到酶分 子中，其中有 4 个是原来水分子结合的位点
– 对酶活性中心结合位点的影响
• 减少整个活性中心的数量，活性中心数目丧失的多少取决于溶 剂的疏水性强弱 • 溶剂分子能渗透入酶的活性中心，与底物竞争酶活性中心的结 合位点，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力 • 例：甲醇可进入辣根过氧化物酶的活性中心，与铁卟啉配位结 合
– 有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用
• (1) 有机溶剂与酶直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改 变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活 • (2) 有机溶剂和能扩散的底物 / 反应产物相互作用，影响正常 反应的进行 • (3) 有机溶剂直接和酶分子周围的水相互作用
– 对酶分子表面结构的影响
第三节 酶在有机介质中的催化特性
• 底物专一性
– 有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发 生改变，致使酶的底物特异性发生改变
– 解释：疏水性的相对强弱
– 不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样
– 极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应
– 极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应
• 引起全球关注的“非水相酶催化”的报道
– Porcine pancreatic lipase catalyzes the trans-esterification reaction between tributyrin and various primary and secondary alcohols in a 99 percent organic medium. Upon further dehydration, the enzyme becomes extremely thermo-stable. Not only can the dry lipase withstand heating at 100 degrees C for many hours, but it exhibits a high catalytic activity at that temperature. Reduction in water content also alters the substrate specificity of the lipase: in contrast to its wet counterpart, the dry enzyme does not react with bulky tertiary alcohols.
第一节 酶的非水相催化概论
• 非水相酶催化的优势
– 增加某些底物的溶解度
– 改变反应平衡
源自文库
– 改变或提高酶的选择性
酶非水相催化的几种类型
有机介质中的酶催化
有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂 中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏 水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持 其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化 功能。
– 水对酶催化反应速率的影响
• 典型的非水酶体系中水含量通常只占 0.01%，但其 微小差距会导致酶催化活力的较大改变 • 最适含水量：在酶催化反应速率达到最大时的水含 量
– 酶含水量 < 最适含水量，酶构象过于“刚性”而失活 – 酶含水量 > 最适含水量，酶构象过于“柔性”，因变构而 失活
• 同一种酶，反应系统的最适含水量与有机溶剂的种 类、酶的纯度、固定化酶的载体性质和修饰性质等 因素有关
– 胶束体系
• 正胶束体系（normal micelles system）
– 水为主体，表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，酶在液 相主体中，反应在胶束两相界面进行
• 反胶束体系（reverse micelles system）
– 有机溶剂为主体，表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外， 酶在反胶束内部的水相中，反应在胶束两相界面进行
• 常见的有机介质体系 —— 胶束体系示意图
有机介质中水对酶催化反应的影响
• 微水有机介质中水的分布和形态
– 结合水
• 与酶粉水合的结合水、固定载体和其他杂质的结合水
– 自由水
• 溶于有机溶剂中
• 与酶结合的水量，以及水在酶分子中的位置是影响酶的活 力、稳定性以及专一性的决定因素
• 水对于酶催化活性构象的获得与保持是必须的，但水也与 许多酶的失活过程有关，即水对酶催化反应具有双重作用
• 强极性有机溶剂对酶的结构和活力影响较大，适用的酶较少
– 例：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）在此 类介质中能催化酚类或芳香胺的聚合
– 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系
• 由水和疏水有机溶剂组成两相或多相体系 • 游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机 相，固定化酶则悬浮于两相的界面；催化反应在两相界面进 行
Chapter 8 Enzymatic catalysis in Nonaqueous system
酶的非水相催化
非水相酶催化反应
• 人类认识的进步
– 长期以来，人们认为酶只能在水相中进行催化，而有 关酶的催化理论是基于酶在水溶液中催化反应建立起 来的传统的酶学理论认为，有机溶剂是酶的变性剂、 失活剂，酶在非水相中不具有催化能力
– 水活度（water activity）
• 为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling 建议用“水活度” 描述有机介质中酶催化活力与水的关系
• 水活度（Aw）
– 体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比，近似等于体系中 水的蒸气压与相同条件下纯水的蒸气压之比
• 最适含水量与溶剂极性成正比，而最佳水活度与溶剂极性大小 无关，故采用水活度作参数更确切 • Aw 值较小
– 1984 年之后，非水相中的酶催化研究开始活跃起来。 – 近年来，人们对非水介质中的酶结构与功能、酶作用 机制、酶作用动力学等进行了大量研究，建立起非水 酶学（non-aqueous enzymology）。
– 同时人们还对酶催化的介质进行了大量研究，开发出 各种非水介质和新的酶促反应体系，发展出了介质工 程（medium engineering），拓宽了酶催化反应的应 用范围，使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互 补充的合成方法。
– 水分子直接或间接地通过氢键、疏水键、范德 华力等非共价相互作用来维持酶的催化活性所 必需的构象
• 酶分子周围水的存在（水化层），能降低酶分子中 极性氨基酸残基之间的相互作用，防止产生不正确 的构象 • 必需水（essential water）
– 定义：维持酶分子完整的空间构象所必须的最低水量，通常是与 酶分子紧密结合的一层左右的水分子，即水化层 – 不同酶与必需水结合的紧密程度，以及所结合的必需水数量是不 同的 – 必需水是维持酶分子间次级键所必需的，是维持酶构象的“润滑 剂”
• 由有机溶剂和微量水组成的反应体系，即通常所说的有机介质 体系
• 大部分的微量水以酶分子的结合水形式存在，对维持酶分子的 空间构象和催化活性至关重要；另一部分水分配在有机溶剂中 • 酶以固态的形式悬浮于有机介质中
– 与水溶性有机溶剂组成的均一体系
• 水 / 极性有机溶剂混溶体系，水和有机相的比例都很大，酶和 底物以溶解的状态存在于此体系中
离子液介质中的酶催化
酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在 室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、 立体选择性、键选择性等显著特点。
第二节 有机介质中水和有机溶剂 对酶催化反应的影响
人类认识的进步
– 1966 年，Dostoli 和 Siegel 分别报道胰凝乳蛋白酶和辣 根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力
– 1975～1983 年间，Buckland 和 Martinek 等对游离酶 和固定化酶在有机溶剂中合成类固醇及甾醇转化中的 应用进行了大量的探索 – 1977 年，Klibanov 等人报道了在水/氯仿两相体系中脂 肪酶催化 N-乙酰-L-色氨酸与乙醇的酯化反应，在水中 收率极低，而在两相体系中竟达到 100% – 1984 年，Zaks 和 Klibanov 在 Science 杂志上发表了一 篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的文章，他们 指出，只要条件适合，酶可以在非水体系中表现出活 性，并催化天然或非天然的底物发生转化，这一报道 引起了全球科学界的关注
• 对映体选择性
– 对映体选择性（enantioselectivity）是酶在对 称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大 小的指标。
– 酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在 疏水性强的有机介质中对映体选择性较差
• 区域选择性
– 区域选择性（regioselectivity） ，即酶能够选择性地 催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应
• 水含量高，稳定性低
• pH 特性
– “pH 记忆”（pH imprinting）现象
• 在有机介质中，酶所处的 pH 环境与酶在冻干、溶 剂沉淀或吸附到载体上之前所使用的缓冲液的 pH 相同，也称“pH 印迹”
– 原因 ——“必需水”
• 在有机溶剂中酶分子表面的“必需水”只要在特定 的 pH 和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因 才能处于最佳的离子化状态，当酶分子从水溶液转 移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在 有机介质中
• Zaks A., and Klibanov A. M., Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C, Science, 1984, 224: 1249-1251 (DOI: 10.1126/science.6729453)
• 人类认识的进步