二乙酰一肟检测尿素

滤后，于 525 nm处测定吸光值。
4
结果
由于正常牛奶中含有少量的尿素，所以正常牛奶的反
应试管也是有颜色的，由于尿素含量较少，所以颜色为淡
红色。尿素含量异常的牛奶，反应后颜色为玫红色。两者
的区别明显，在实际的质量控制中，应以正常奶做比较，
来判断原料奶中尿素含量的水平，进而做出判断。
5 小结
优点：灵敏度高，操作简单，适用于自动仪器分析。 缺点：反应不专一，线性范围窄（<150mmol/L),特异 性低，试剂腐蚀性强，加热有异味释放。难以实现自
混匀。再加入安替比林溶液2.00ml，混匀。
动的自来水中冷却2min。以水为对照，于460nm处，用1cm 比色皿测定各管吸光度。 3.4 计算标准系列直线回归方程，以水样吸光度代入方程，
求出水样尿素含量。
4 小结
与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操
作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；
导致测定结果不准确的弊端;方法的精密度、准确度好,优于原 法,且符合卫生检验的要求。
国标法改进前后对照表
加热时间 优点 缺点
改进前
50分钟
灵敏度、重现性、 费时、遇光易褪色、 线性范围窄 回收率高
改进后
20分钟
精密度、准确度好
省时、显色较稳定、 线性范围宽
二乙酰一肟-氨基硫脲 （thiosemicarbazide）法
2 试剂
2．1 0．2％二乙酰一肟溶液：称取0．2g二乙酰一肟 ［CH3COC：（NOH）CH3］溶于10％乙酸中，并稀释至100ml， 保存于棕色瓶备用。 2．2 0．2％安替比林溶液：称取0．2g安替经林（1，5 －二甲基－2－苯－3－吡唑酮C6H5NN（CH3）C（CH3）：CHC： O），溶于1＋1硫酸中并用混酸稀释至100ml，棕色瓶中保 存。（注：硫酸浓度大于1＋1时，显色缓慢且操作不便。） 2．3 尿素标准溶液：准确称取0．1000g尿素于小烧杯中， 加少量纯水溶解后转入1000ml容量瓶中，加0．1ml氯仿并 用纯水定容，此液每ml含0．1mg尿素。冷藏保存。 2．4 尿素标准使用溶液，准确吸取尿素标准储备溶液 10．00ml于100ml容量瓶中，用纯水定容，此液每ml含 0．01mg尿素。
4 小结
用改进后的二乙酰一肟比色定量法,标准曲线线性范围较
原法有了很大提高,最高浓度可以测到610 mg/L,超过610 mg/L
的水样进行一倍稀释基本上均在标准曲线线性范围以内, 并保 持原法的精密度与回收率; 煮沸时间由原来的50 min缩短至20
min,消除了由于长时间煮沸造成的各管溶液体积不一致、从而
存于棕色瓶中。
2．2 安替比林溶液(2 g/L) :取0．2g安替比林[C6H5NN (CH3 )C(CH3 )CHCO]溶于1 + 1硫酸中并稀释至100 ml,保 存于棕色瓶中。 2．3 尿素标准储备溶液(100μ g/ml)和尿素标准使用溶液 (10μ g/ml) 。 2．4 仪器和器材 UV - 2102C型分光光度计、沸水浴锅、25 ml棕色具塞比 色管(粗细、玻璃厚薄均匀一致) 。
沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿 素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获 得满意结果。
临床与预防二乙酰一肟法的区别
线性范围
准确度、精密 度
味道
反应时间
临床
窄
低
加热有异味
长
预防
宽
高
无
短
3 讨论 3.1 尝试以异丙醇、异丁醇、正戊醇、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、 丙醇、正丁醇、甲醛、正辛醇、异戊醇等十余种有机溶剂作显色稳 定剂试验，结果显示：甲醛使显色无法进行；正辛醇、异戊醇水溶 性差，溶液出现混浊；其余试剂均有显色稳定作用，但以异丙醇显 色后最稳定，灵敏度较高，水溶性好，且为常用试剂，无毒，易购 得，故选之。异丙醇的使用，弥补了标准方法 3.2 经实验，异丙醇用量在0.4~0.6ml/管时，空白值较低，灵敏度 较高，稳定性好，故选其中间值（0.5ml/管），按此比例将其与二 乙酰一肟试剂混合后加入，操作方便，且不影响二乙酰一肟试剂的 稳定性。 3.3 当二乙酰一肟溶液用量为1ml/管，其浓度为10g/L与20g/L时， 灵敏度较高，且两者基本相同，而当其浓度为2g/L时，灵敏度大大 降低，故选其浓度为10g/L。因其与异丙醇混合后一次加入，为达 二物质最佳显色量，故该混合试剂加入量为1.5ml。
2．2 二乙酰一肟溶液 2．3 尿素标准贮存液
200ml，棕色瓶冷藏可保存半年。 后，移至1000ml容量瓶中，加5滴三氯甲烷作防腐剂，用纯水 定容至刻度。4℃保存，此溶液尿素浓度为0.1mg/ml。 2．4 尿素标准使用液 临用时将尿素标准贮存液稀释10倍。 此溶液尿素浓度10ug/ml。
3 操作步骤
原理：尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪
衍生物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故
通常用二乙酰一肟代替，它与强酸作用，产生二乙酰。后者
再与尿素反应，缩合生成红色的二嗪衍生物。
临床二乙酰一肟法
二乙酰一肟+水 → 二乙酰+羟胺 二乙酰+尿素 → 二嗪化合物（粉红色）
H+ H+
泳池二乙酰一肟法
1．原理
尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸环境中
加热，生成红色的二嗪衍生物。显色强度在一定范围内与
尿素含量成正比。
2 试剂
2．1 酸性试剂 浓硫酸200ml与磷酸300ml混匀，冷至室温。加 称取4.0g二乙酰一肟，溶解后加纯水至 准确称取0.1000g尿素，加少量纯水溶解
氨基硫脲50mg，硫酸镉2.0g溶解，棕色瓶冷藏至少可保存一年。
3．1取水样10ml于具塞标准比色管中。另取比色管8只，分别
加入10ug/ml的尿素标准使用液0、0.10、0.25、0.50、
1.00、2.00、3.00、5.00ml，各加水至约10ml。 3．2 每管各加酸性试剂5.0ml，2%的二乙酰一肟溶液2.0ml， 加纯水至25ml。沸水浴12分钟，取出后用冷水冷却至室温。 3．3 以空白管调零，在540nm处，用1cm比色皿测定各管吸光
此液1.00ml含0.100mg尿素。
2.4 尿素标准使用液 吸取尿素标准贮备液10.00ml于 100ml容量瓶中，以水定容，此液1.00ml含10. 0ug尿素。
2.5 实验用水均为去离子水。
3 测定步骤
3.1 吸取水样10.0ml于25ml无色具塞比色管中，另取同型 比色管分别加入尿素标准使用液0、0.20、0.50、1.00、 2.00、3.00、4.00、5.00ml，以水定容至25ml。 3.2 3.3 于上述各管中加入二乙酰一肟-异丙醇溶液1.50ml， 各管加塞后同时置沸水浴中加热20min，取出，在流
动化。
常采用卫生部颁发的二乙酰一肟分光光度法(简称原法) 。
二乙酰一肟分光光度法（国标法）
1. 原理
尿素与二乙酰一肟及安替比林反应呈现黄色, 在波长
460 nm 处有最大吸收峰,与标准系列比较定量。
2
试剂
2．1 二乙酰一肟溶液(2 g/L) : 取0．2g二乙酰一肟 [CH3COC (NOH) CH3 ]溶于10% 乙酸中,并稀释至100 ml,保
＋ 二乙酰一肟 H 2 O
双乙酰 ＋ 尿素
H＋
双乙酰＋羟胺
二嗪衍生物 红色 （ ）
H＋
临床二乙酰一肟法测定尿素
1 原理
尿素与二乙酰一肟在酸性条件下，经镉离子（或三价铁 离子）的催化产生缩合，并在氨基硫脲存在下，生成了4，5-
二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
2 试剂
2．1 酸性试剂：在 1 L容量瓶中加入蒸馏水约 100 mL，
3 方法
3．1 定性测定：取使用液 2 mL 加入试管中，加 0.1 mL
牛奶，在电炉上快速加热至煮沸，保持沸腾 1 min，观察
颜色，用不含尿素样品做比较。正常奶颜色为淡红色， 添加尿素的牛奶反应颜色为玫红色。 3．2 定量测定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL
的螺口试管中，加盖拧紧，于 95 ℃水浴中反应 20 min，过
2 试剂
2.1 二乙酰一肟-异丙醇溶液 称取1.0g二乙酰一肟溶于 1+9乙酸溶液中，并使其总量为100ml，于此溶液中加入异丙 醇50ml，混匀，棕色瓶中保存。 2.2 2.3 安替比林溶液 称取0.2g安替比林溶于1+1硫酸中，并 称取0.1000g尿素，溶于少量水后移 使其总量为100ml，棕色瓶中保存。 尿素标准贮备液 入1000ml容量瓶中，加0.1ml氯仿并用水定容，冷藏保存，
3 分析步骤
3．1取游泳池水样10 ml于25 ml比色管中。另取尿素标准使用 溶液( 10μ g/ml) 0、0．25、0．50、1．00、2．00、3．00、 4．00、5．00、6．00 ml (尿素含量为0、2．5、5、10、20、 30、40、50、60μ g) ,各管加纯水至10 ml,做标准系列。 3．2样品及标准系列管各加入110 ml二乙酰一肟溶液,摇匀,再 加入210 ml安替比林溶液,混匀后置沸水浴锅中煮沸20 min (建 议同时放入同时取出,或按次序放入、取出,以保证加热时间的 一致。在样品多时这点尤为重要) ,在沸水浴时轻轻盖上比色管 塞,以防溶液蒸发。 3．3停止加热后在冷水浴(10℃～15℃,冷水浴水位高于比色管 中溶液为佳) 中冷却2 min, 再次混匀后以纯水为对照, 在460 nm处,用1 cm 比色皿,在避免阳光直射的条件下测定吸光度。绘 制标准曲线并求得样品中尿素的浓度。
3 分析步骤
3．1 吸取水样10ml（尿素含量在0．001～0．015mg范围内） 于25ml棕色具塞试管中，另取棕色具塞试管加入尿素标准使 用液0、0．1、0．3、0．5、0．7、0．9、1．1、1．3、 1．5ml，并用纯水稀释至25ml。（注：显色后溶液遇光退色， 故需用标色法）。 3．2 于上述各管加入1．0ml二乙酰—肟溶液，混均。再加 安替比林溶液2．0ml，混匀。 3．3 将上述试管在沸水浴中加热50min。取出并在流动的 自来水中冷却2min。立即以纯水为对照，在460nm处，用1cm 比色皿，测定各管吸光值（加热45～55min，呈最深色，若 再延长时间吸光值下降）。 3．4 以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样吸光值从 曲线上查出尿素含量。
4 小结
优点：操作简便、灵敏度高。 缺点：线性范围窄、反应时间长、标准曲线相关系数难 以达到0.1999以上，对于尿素浓度高的水样,虽可将水样稀释 后进行测定,但稀释倍数难以估计, 所以需反复重测 , 既费 时,又浪费试剂。
1 原理Fra Baidu bibliotek
目前二乙酰一肟-安替比林分光光度计[ 1] 是测定尿 素的唯一标准方法, 该法存在标准曲线线性范围较窄
简 介
尿素又称脲，是体内蛋白质分解代谢的含氮终产物，不 与血浆蛋白结合，分子量仅为60，体内生成量受蛋白质摄入
量，机体蛋白质分解代谢及肝脏（生成尿素的唯一器官）功
能的影响。 尿素是表明游泳池水受到人体污染程度的一项重要指标。
二乙酰一肟（diacetylmonoxime） 法检测尿素（urea）含量
化学式
CH5N3S H N
起主要作用
氨基硫脲
结构式 作用
H2N
C II S
NH2
酸性试剂中的氨基硫脲与硫酸 镉可促进尿素与双乙酰结合，提高 灵敏度和显色后的稳定性。
反应关系式
2（NH2)2-C=O + 2（NH2)2-C=S-----（NH2)2-C=C(NH2)2 + SO2 + S
（尿素） （氨基硫脲）
值。以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样的吸光值
在标准曲线上查出尿素含量。
4 结果
本法操作简便，溶液显色稳定，线性范围宽，试剂 稳定时间长，适合平时工作中使用。
二乙酰一肟-异丙醇-安替比林法
化学式
（CH3）2CHOH OH
异丙醇
结构式
H3C
CH
I
CH3
作用
作显色稳定剂。
1 原理
在原发的基础上，选择异丙醇作显色稳定剂对游泳池 水中尿素进行测定，使标准曲线的线性范围有了很大的提 高，缩短了煮沸时间，方法的精密度、准确度优于原法， 且符合卫生检验要求。
然后加入浓硫酸 44 mL 及 85 %磷酸 66 mL，冷却至
室温后加入硫氨脲 80 mg，硫酸镉 2 g，溶解后用蒸馏 水稀释至 1 000 mL，贮棕色瓶中放冰箱内保存半年 不变。 2．2 2 %二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸馏
水中，定容 100 mL混合均匀，即可使用。
尿素使用液：取酸性试剂 90 mL加 2 %二乙酰一 肟 10 mL，混合均匀即可。
( 011 ~ 11 5 m g /L), 吸光度偏低,反应产物不稳定, 溶液
显色后遇光褪色等多种问题, 对检测结果影响较大, 为此 本法参阅有关文献[ 2, 3] , 通过摸索, 将国标法中的标准 曲线扩大, 定容体积由25 m l改为10 ml, 使线性范围变宽, 吸光度的值增大, 标准系列的稳定时间长, 结果满意, 其准 确度、精密度较好, 能满足基层实验室的需要。