实验三 α-淀粉酶的初步纯化

四、实验方法
硫酸铵盐析沉淀α-淀粉酶 按硫酸铵的饱和度为55％的比例，将硫酸铵缓慢 加入到收集的滤液中，一边加(NH4)2SO4，一边轻 轻搅拌。尽量避免液面泛起白色泡沫。完全溶解 后在4℃下沉淀过夜，使上清液中的蛋白质沉淀下 来。次日将三角瓶取出，将溶液以4 000 r· min-1 转速离心15 min，收集沉淀，然后在烘箱中于 50~60 ℃干燥（损失率应不高于30％），即得粗 酶制剂。
五、实验结果
酶的总活力（即酶产量）
＝酶液总体积×酶的比活力 酶的纯化倍数
＝某纯化步骤的比活力/第一步的比活力
酶活力回收率
＝(某纯化步骤的总活力/第一步的总活力)×100%
五、实验结果
步骤 总量 (g) 发酵液 提取液 硫酸铵 沉淀酶 干燥后 比活力 酶的总 纯化倍 数(×) 回收率 (％)
(u/g) 活力(u)
四、实验方法
发酵液的预处理
将培养2 d 后的发酵液收集起来，过滤滤去 菌体，收集滤液，测量其体积。取5 mL出 来留作淀粉酶的活力测定，剩余发酵液则进 行初步纯化。在剩余发酵液中加入CaCl2 和 Na2HPO4 各0.8%-1%进行絮凝作用，并加 热到55~60 ℃处理30 min，以破坏蛋白酶， 促使胶体凝聚后再过滤，收集滤液，测量其 体积，并测酶活力。
四、实验方法
有机溶剂沉淀α-淀粉酶 在25ml滤液中，一边缓慢加入冰冻乙醇， 一边轻轻搅拌，至乙醇终浓度为70%，观察 有无沉淀析出。亦可在4℃下沉淀过夜，使 上清液中的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶 取出，将溶液以4 000 r· min-1 转速离心15 min，收集沉淀，室温风干，即得粗酶制剂。
的成品
思考题
发酵液为什么要进行预处理 如何进行发酵液预处理？
ห้องสมุดไป่ตู้
浓缩液 配方
浓缩
分离纯化 （离心、沉淀、膜分离、 层析、电泳、萃取、结晶） 配方、制剂
干燥
固体酶
液体酶
干燥 液体酶
固体酶
二、实验原理
α-淀粉酶是一种胞外酶，胞外酶的初步分 离纯化通常是将发酵液经过预处理后采用 过滤或离心的方法将酶液与菌体分离，然 后在酶液中加入(NH4)2SO4 盐析沉淀获得 酶泥，最后干燥即可。
实验三 α-淀粉酶的初步纯化
一、实验目的
掌握酶制剂提取工艺流程。
掌握淀粉酶的分离方法、纯化方法、浓缩 方法和干燥方法。
二、实验原理
发酵液
预处理（细菌絮凝）
固液分离（离心、过滤） 菌体（胞内酶） 动植物源酶 液体（胞外酶）
细胞破碎
提取
固液分离
液体
工业、食品、饲料
医药、分析、科研
浓缩 （蒸发、超滤、沉淀）
三、仪器和试剂
仪器：
分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0. 1℃）、 干燥箱、离心机、移液管、试管、烧杯、容量瓶、 玻璃棒、三角瓶、秒表、标签、培养皿、量筒、 漏斗、中速滤纸。 试剂：
碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠 檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有 限公司）、氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸铵、乙醇。
二、实验原理
在酶的分离纯化过程中，每步都需要测定 酶活力、蛋白质含量和体积，以计算酶的 总活力、总蛋白和比活力，进而计算酶活 力回收率和纯化倍数，以监测每步纯化步 骤中酶的回收和纯化效果，从而可以判断 每步所使用的纯化手段是否适宜目的酶的 分离。
二、实验原理
盐析法是蛋白质溶液中加入盐到一定限度 后继续加盐，蛋白质从溶液中析出。其原 理主要是蛋白质在高盐离子浓度下表面电 荷被中和，水膜被破坏，蛋白质分子间疏 水部分吸引力增加，以致沉淀析出。
Ks分段盐析 、β分段盐析
二、实验原理
有机溶剂沉淀法是利用酶与其它杂质在有机溶剂
中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶 剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂
的存在会使溶液的介电常数降低。从而使溶质分
子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。
有机溶剂与水相互作用，破坏溶质分子表面的水 膜，使其溶解度降低而沉淀析出。