20疫苗制备工艺

20.2 疫苗菌毒株的建立
2 样品转移和预处理
• 不同的样品来源和采集方法，采用不同的样品转移和处理 方法 • 所有样品均带有清楚的标签
3 培养基的制备
• 病原菌培养中常用营养肉汤、琼脂和蛋白胨水等
• 培养基PH值一般在7.2-7.6 • 通用增菌培养基和专用增菌培养基，选择培养基，鉴别培 养基，厌氧培养基。
细 菌 毒 素
甲醛
类毒素
影响脱毒因素
PH
脱毒
甲醛 浓度
温度
•
温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性，一般37～
38 ℃。
•
在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，可导致脱毒 过甚；在碱性时脱毒快，但 抗原性损失较大，一般采用弱碱性。
•
甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。
类毒素的毒性逆转
1. 温度升高加快毒性逆转，游离甲醛的浓度越低越易发
和对相应抗体的特异性结合反应）。
将标准和待检类毒素不同倍数稀释，免疫小鼠或豚鼠后用 毒素攻击，对动物的保护率≥80％；或用vero细胞检测血 清中的抗体滴度。
破伤风类毒素制备工艺
• 破伤风产毒用菌种、保存和传代 • 产毒用培养基 • 培养和产毒 • 脱毒 • 类毒素的浓缩和精制
• 除菌过滤
• 吸附精制类毒素的制备
疫苗种类
1 2 3 4 5
霍乱 伤寒 副伤寒 百日咳 疫苗……
卡介苗 鼠疫 布氏杆菌 伤寒 痢疾 霍乱 疫苗……
白喉 破伤风 百日咳 乙型肝 炎疫苗 ……
脑膜炎 伤寒vi 肺炎疫 肺炎疫 流感嗜 血杆菌 多糖疫 苗……
AC脑膜 炎球菌 多糖结 合疫苗 HIB……
白喉疫苗
一、概述 二、病原学 三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学 四、白喉毒素 五、白喉类毒素 六、生产工艺 七、类毒素的质量检定
• 英国医生琴纳认为牛痘可以预防天花，1976年通过实验
证实了他的想法。 • 免疫由法国科学家巴斯德开始研究。研究了减毒炭疽疫苗 免疫实验，1985年制备了狂犬减毒活疫苗。
天花疫苗接种
20.1 概述
3 疫苗的发现
• 20世纪60年代以前，人们确立了很多能防病的疫苗，包括
死疫苗，活疫苗以及类毒素疫苗。 • 20世纪70年代，开始制备无细胞疫苗。如百白破疫苗。 • 1974年多糖疫苗。 • 20世纪80年代以后，基因工程疫苗。乙肝疫苗。
• 絮状单位测定 毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反 应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼 可见的絮状凝集反应， 根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（ Lf） 值。
• 纯度：≥1500Lf/mgPN
• 安全性试验（豚鼠）
• 效价测定（即类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答
三 白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学
• 自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成人工 感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感，小白鼠对白喉
不敏感，实验室常用的动物是家兔和豚鼠。
• 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的，白喉 杆菌的产毒基因是由β嗜菌体携带， β嗜菌体感染无毒 白喉杆菌后，嗜菌体DNA与细菌DNA整合， 形成溶原 性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前用于白喉类毒 素生产)。
• 1937年试用流感病毒减毒活疫苗，1960年开始大量人体 试用。
• H3N2亚型毒株出现之前，多用鸡胚连续传代法选育减毒
株。出现之后，发现连续传代30代之后仍不能对人减毒。 因此需用其他方法选育减毒株。 • 主要用以下两种方法： • 冷适应减毒法
• 基因重配减毒法
20.5 基因工程重组乙肝疫苗的制备工艺
一 抗原表达载体和宿主细胞
• 表达载体：痘病毒，腺病毒，麻疹病毒等位病毒载体；沙 门菌和卡介苗为常用的细菌载体。
• 宿主细胞：细菌，酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞等。
20.5 基因工程重组乙肝疫苗的制备工艺
二 酵母系统生产重组乙肝疫苗
• 1986年，美国MSD公司。 • 其后，比利时SKB。 • 1991年，Kuroda S等报道的TGP-943疫苗，能使无应答 者产生应答。 • 工程菌的构建 抗原制备 种子制备 制剂成型 发酵罐培养
20.2 疫苗菌毒株的建立
一 病原细菌的分离
• 致病性细菌常存在于人的呼吸道、口腔胃肠道、黏膜或皮 肤以及血液等组织器官。但经常不存在与一个部位。
1 采样
• 呼吸道感染：鼻腔、口腔、支气管等部位用拭子 • 口腔胃肠道感染：口腔拭子，如伤寒和霍乱 • 泌尿系统感染：留尿 • 脓疮：局部采样
• 活组织采样
琼脂培养基上菌落周围可见溶血环。 • 通过凝集效果鉴别菌落。
3 菌种鉴定
20.2 疫苗菌毒株的建立
三 B群链球菌和肺炎球菌的分离 课外选读，需搞清楚一下问题：
• B群链球菌和肺炎球菌在人体哪些部位寄生？ • 溶血性细菌的分离及其鉴别方法？ • 血清学鉴定的过程？
20.2 疫苗菌毒株的建立
四 病毒的分离 病毒需在宿主细胞中繁殖生长 1 采样
• 培养菌体或细胞，合成抗原物质 • 收集，纯化制备抗原（破碎离心过滤等）
• 成型（加佐剂或生理缓冲体系）
• 生化试验，安全性试验等
20.1 概述
四 疫苗剂型与配伍
液体疫苗
• 抗原成分 • 缓冲液 • 杀菌剂和防腐剂 • 保护剂 • 活疫苗，化学成分明确
疫苗剂型 决定因素
冷冻干燥疫苗
• 冻干效果受溶剂和保护剂 以及工艺灯影响 • 真空度和水分影响稳定性
硫酸铵盐析 两段盐析 除盐除菌 脱毒 原液 氨离子及无菌检查 0.5％甲醛液 37℃ 40～50天 脱毒试验（家兔） 检定（浓度、纯度、安全等） Al(OH)3吸附 检定（安全、效价等）
成品
七 类毒素的质量检定
• 絮状单位（Lf）
是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量” 而 不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类 毒素的絮状单位。
20世纪80年代，以纯化的抗原为主要成分的无细胞疫苗 主
要有蛋白质疫苗，多糖疫苗，多糖-蛋白质结合的疫苗。
菌体培养主要区别在于培养基成分的不同。
固体培养：第一代培养物在大试管培养物中培养，再接种于 大克氏瓶，之后悬于生理盐水中。 悬浮培养：与常规的发酵培养过程相同，试管接种，三角瓶 液体培养，种子罐培养，发酵罐培养。
20.1 概述
二 疫苗的分类
• 病毒、细菌疫苗，到寄生虫、肿瘤、避孕疫苗。
• 预防性疫苗到治疗性疫苗。 • 灭活疫苗
传统疫苗
• 减毒活疫苗 • 亚单位疫苗 • 遗传重组疫苗
根据生产技术
新型疫苗
• 合成肽疫苗 • 抗独特型抗体疫苗
20.1 概述
三 疫苗制备的基本过程
• 菌毒株进行优化和筛选，建立完善的毒种库
20.5 基因工程重组乙肝疫苗的制备工艺
三 CHO细胞生产重组乙肝疫苗
• CHO工程细胞系的建立 • CHO工程细胞培养 • 抗原的分离与纯化 • 制剂成型
四、白喉毒素
• 白喉毒素对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、
肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。 • 白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为 62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55℃很快失活。 • 通过物理和化学方法将其纯化。
五、白喉类毒素
类毒素经是甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性
20.2 疫苗菌毒株的建立
二 百日咳菌的分离 1 分离
• 患者咳嗽时，将琼脂平皿培养基对准患者，直接收集带菌 的飞沫于培养基上，直接培养，35-37℃ • 无菌棉棒深入患者咽喉，然后转至培养基上培养，3537℃
20.2 疫苗菌毒株的建立
2 菌落选择
• 菌落易鉴别，灰白色，突起，较小，珍珠样，在含血包姜
• 目前广泛使用的是纯化三价裂解苗或全病毒灭活疫苗。
20.4 病毒性疫苗的制备工艺
2 三价活流感疫苗的制备过程
• 鸡胚接种流感疫苗，33-37℃， 48-72h • 收获培养液，弃沉杂，加甲 醛灭活 • • • 浓缩和纯化 脱糖（透析） • • • • 鉴定
三价按1：1：1合并
•
半成品鉴定
• 分装 成品鉴定 保存
抗原组成
使用途径 口服丸剂疫苗
• 脊髓灰质炎糖丸疫苗
• 痢疾疫苗
20.2 疫苗菌毒株的建立
• 疫苗制备是由分离、筛选、培育、改造及保管具有高 度免疫性 的微生物种子开始。 • 传统疫苗由抗原性较全。免疫力较高的细菌或病毒培
养后杀死制成死疫苗，或经人工减毒以后制成活疫苗。
• 现在的基因疫苗或DNA疫苗等是经对原始致病微生物 的致病性、免疫化学、抗原的研究开发出来的。
除菌（超滤或紫外）
20.4 病毒性疫苗的制备工艺
3 质量控制
• • 无菌试验 病毒滴定 • • 神经氨酸酶活性 游离甲醛酶活性
•
• • • •
灭火实验
安全实验 总蛋白含量
•
•
游离甲醛含量
硫柳贡含量 • • • 内毒素 PH值 外观
Fra Baidu bibliotek
血凝素蛋白含量 卵清蛋白含量
20.4 病毒性疫苗的制备工艺
二 流感病毒减毒活疫苗制备工艺
一 概述
白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。 它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病 细菌产生 的外毒素 对心肌损 害
外毒素 对神经 系统损 害
外毒素 对肾脏 损害
主要临床表现为上呼吸道发炎， 常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，
白喉流行三个特点
• 传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的 细菌没有中间宿主，病人及带 菌者是一的传染原。 • 传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也 可通过被污的器具和食物传 播。 • 易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1 岁时白喉易感性达高峰。
生毒性逆转，毒素纯度高易发生毒性逆转。
2. 提高脱毒pH， 提高甲醛浓度， 提高脱毒温度和延长 脱毒时间均可减轻毒性逆转；精制类毒素中非蛋白氮 含量高者逆转程度小，于精制毒素中加入赖氨酸、精 氨酸等可明显防止或减轻毒性逆转。
六、白喉疫苗工艺流程示意图
菌种（ PW8株 ）
传代扩增 3～ 4代
发酵罐培养 34～35℃培养40～48h对数生长 末期收获，甲苯杀菌。 离心去菌体 收集清液 超滤浓缩 3万分子量超滤浓缩
20.4 病毒性疫苗的制备工艺
一 流感病毒灭活疫苗制备工艺 1 流感疫苗的研究
• 20世纪30年代，开始进行流感病毒灭活疫苗的动物实验。 不能用于人体。 • 1937年，鸡胚培养流感病毒获得成功，使生产成为了可 能。 • 20世纪60年代，裂解的纯化疫苗。 • 20世纪80年代，亚单位疫苗，可用于儿童。
第二十章 疫苗制备工艺
20.1 概述
一 疫苗的发展历史
1 概念
• 疫苗是指一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机 体产生针对特定病原的特异性抗原或细胞免疫，从而 使机体获得预防或消灭该病原能力的生物制品。 • 防病物质。 • 现有约20余种疾病的疫苗，其中半数是病毒疫苗。
20.1 概述
2 疫苗发现
二 病原学
• 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有 着色 较深 的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜， 不行成芽孢。 • 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解葡萄 糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生 吲哚，不消化蛋白。 • 白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极 敏感；对消毒剂抵抗力弱，1％石碳酸1min或3％苯酚 10min可将该菌杀死。不耐热，58 ℃ 10min或100 ℃ 1min即可被杀死。
3 宿主细胞的选择和接种
选择以下三类细胞：
原代细胞
二倍体细胞 异倍体细胞
20.2 疫苗菌毒株的建立
4 细胞培养分离病毒
样品细胞在含小牛血清及抗生素的细胞培养基中培养，于 37℃，含0.05-0.1的二氧化碳培养箱中培养。
5 病毒的检查和确认
20.3 细菌性疫苗制备工艺
传统的菌体疫苗分死疫苗和活疫苗。
取样部位 鼻腔，咽喉 痰 分离的病毒 呼吸道感染病毒，流感，疱疹，麻疹等 腺病毒，巨细胞病毒，疱疹，流感等
粪便或直肠
血液 尿 疱疹 脑脊液
肠道病毒
巨细胞病毒，麻疹，带状疱疹 巨细胞病毒，腮腺炎病毒，腺病毒 肠病毒，疱疹，带状疱疹 肠道病毒，单纯疱疹
20.2 疫苗菌毒株的建立
2 转移和预处理
总原则：不同的样品来源和采集方法，采用不同的样品转移 和处理方法；所有样品均带有清楚的标签。