惠州地区淋球菌对抗生素耐药性研究

惠州地区淋球菌对抗生素耐药性研究

目的探究惠州市淋球菌对四环素、环丙沙星、青霉素、大观霉素和头孢曲松的耐药情况。方法采用琼脂稀释法测定淋球菌对5种抗生素的最低抑菌浓度。用纸片酸度法检测产青霉素酶淋球菌菌株。结果118株淋球菌对四环素、青霉素与环丙沙星的耐药率分别为77.97%（92/118）、73.73%（87/118）和39.83%（47/118）；抗菌药物的最终浓度：青霉素为0.125～8 mg/L，四环素为0.25～16 mg/L，环丙沙星为0.03～2 mg/L，大观霉素为4～64 mg/L，头孢曲松为0.002～1 mg/L。4株对头孢曲松耐药的菌株，同时也对四环素、青霉素以及环丙沙星有耐药作用。结论淋球菌对四环素、环丙沙星和青霉素耐药率较高，对头孢曲松和大观霉素敏感，考虑作为临床治疗淋病的首选药物。

标签：奈瑟球菌；最低抑菌浓度；耐药性

随着淋球菌对青霉素、四环素耐药性的不断增长，治疗淋病的首选药物已经不是四环素与青霉素。淋球菌对多种抗生素耐药性的不断增长，给临床治疗带来了更大的难度，因此，对各种抗生素耐药性的研究十分重要。本课题组对分离出的118株淋球菌进行了检验，给惠州地区淋球菌对抗生素的耐药性及淋病的防治提供了理论依据，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所选研究资料为从惠州市3家医院门诊（2011年1月～2012年10月）的淋病确诊患者的脓性分泌物中所得，在经过氧化酶试验、革兰染色、糖发酵后放置在液氮中进行保存。

1.2 淋球菌标准菌株

本次试验所采用的淋球菌标准菌株均由于中国药品生物制品检定所提供。

1.3 抗生素

中国药品检验所提供青霉素与四环素；环丙沙星：浙江新昌制药公司生产；大观霉素：山东鲁抗医药股份有限公司生产；头孢曲松：上海罗氏制药有限公司生产。

1.4 最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定

使用琼脂稀释法[1]对5种抗菌药物淋球菌中的MIC进行测定，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓

度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时、费力。

1.4.1 培养基的制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH为7.2～7.4。淋病奈瑟菌在使用GC琼脂的基础加1%添加剂；其他链球菌使用含5%（v/v）绵羊血的MH琼脂（试验磺胺药时，使用溶解的马血）。

1.4.2 含药琼脂平板的制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加热溶解，并在45～50℃水浴中平衡的MH琼脂中充分混匀，倾倒入灭菌平皿，琼脂厚度3～4 mm。通常按1∶9配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。将配制好的含药琼脂平板装入密封塑料袋中，置2～8℃冰箱可贮存5 d。

1.4.3 接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再以1∶10进行稀释，以多点接种器吸取制备好的菌液（1～2 μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104 CFU，形成直径为5～8 mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16～20 h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24 h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%CO2，幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

1.4.4 结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制病原菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。

如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。

2 结果

2.1 抗菌药物测定118株淋球菌MIC的结果

抗菌药物的最终浓度：青霉素为0.125～8 mg/L，四环素为0.25～16 mg/L，环丙沙星为0.03～2 mg/L，大观霉素为4～64 mg/L，头孢曲松为0.002～1 mg/L；4株对头孢曲松耐药的菌株，同时也对四环素、青霉素以及环丙沙星耐药有耐药的作用（表1、2）。

2.2 118株淋球菌对抗生素的药敏试验结果

根据世界卫生组织标准判定118株淋球菌对5种抗生素的敏感性，四环素耐药率最高为77.97%（92/118），其次是青霉素和环丙沙星分别为73.73%（87/118）和39.83%（47/118），头孢曲松和大观霉素最低为0.85%（1/118）和4.24%（5/118）（表3）。

3 讨论

从全国2000年淋球菌耐药监测情况看，其中，耐四环素菌株阳性率为6%～62%，产青霉素淋球菌的阳性率为3%～83%，耐青霉素的淋球菌株阳性率为7%～88%，根据美国疾病控制中心的标准，一种抗生素的耐药菌在5%以上时，治疗该病的首选药物就不能选用该种抗生素[2]。因此，惠州地区临床治疗淋病的药物不应再选用四环素和青霉素。喹诺酮类药物属于广谱抗菌药物，主要通过抑制细菌DNA合成，进而发挥其作用。近些年来，氧氟沙星、诺氟沙星等已经被很多的国家应用到淋病的治疗中。但是，随着喹诺酮类药物耐药性的不用增长，在西太平洋地区许多国家该组抗生素已经不再有效。日本的Tanaka等[3]报道，1991～1994年耐环丙沙星淋球菌为3.7%，2000年后升至46.8%。在5种抗菌类的药物中，大观霉素与头孢曲松都有较强的抗淋球菌效果。测出的淋球菌为99.15%，对大观霉素比较敏感，85%具有耐药性，80.51%对头孢曲松敏感，4.24%具有耐药性。实验结果表明，惠州地区耐环丙沙星淋球菌为39.83%，在临床中必须引起高度的重视，在这类药物的使用中特别是在治疗淋病时要小心谨慎。由此可见，惠州地区淋球菌治疗的首选用药，可以选择为头孢曲松与大观霉素。

磺胺类（磺胺嘧啶、磺胺脒）、四环素类（土霉素、地美环素、美他环素）、β-内酰胺类（青霉素）、氨基糖苷类（链霉素、卡那霉素）以及大环内酯素（红霉素、阿奇霉素）是比较常用的抗生素。

β-内酰胺类含有β-内酰胺环与饱和的噻唑环，能够杀死抗头孢霉素、抗铜绿假单胞菌青霉素以及其他抗革兰阴性杆菌青霉素中的细菌，还能将正处在繁殖期中的细菌杀死，是儿科中比较常用的一种抗生素。β-内酰胺类能抑制细菌细胞壁的多肽合成，崩解细菌的细胞壁，造成细菌细胞壁的断裂或缺少，从而使细菌吸收外界的水分导致细菌涨破；β-内酰胺类会激活细菌内部的自溶酶，活化酶能溶解细菌，促使细菌死亡。

大环内酯素类拥有非烷结构，在酸性条件下能维持稳定性，在碱性条件下就会被破坏，一般情况下，大环内酯分为一内酯和多内酯。大环内酯类可以应用于青霉素过敏的患者，对军团类的菌病也有疗效，还可以治疗因衣原体、支原体感染而导致的呼吸道、口腔、肠道等的感染病症。

四环素是抗生素中抗菌范围最大的一种，其对革兰阳性和阴性菌都有效果，对厌氧和好氧类菌也有效果，还对各种支原体、衣原体、立克次体、放线菌等存在疗效，是一种不可多得的广谱抗菌类抗生素。

氨基糖苷类是从微生物的培养液中提取出的半合成类的抗生素中的一种，主要呈现为碱性，可以溶于水。对各类细菌蛋白质的合成与代谢有干扰作用，使得细菌体内的各种遗传信息的复制受到了阻碍，细菌的细胞不能正常的完成复制；蛋白质的代谢被打乱，造成细菌细胞膜中的糖蛋白发生了变化，增加了细胞膜的通透性，造成内液的外漏，最后导致细菌死亡。氨基糖苷类能将稳定期中的细菌杀死，杀死的细菌主要包含流感杆菌、支原体等。