结核分枝杆菌最新检测技术
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。
以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。
2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。
这一步通常包括液体化和浓缩痰液。
3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。
培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。
4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。
5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。
此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。
但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。
结核杆菌抗体测定结果
结核杆菌抗体测定结果随着亚健康慢慢的侵袭了我们的国家，大家开始诚惶诚恐的注意保重自己的身体了。
锻炼身体，吃东西补身体这些就先不说了。
为了防止疾病悄悄的侵袭我们健康的体魄，基本上大家每一年都做至少一次两次的体检，以此来发现身体的问题，好及时的进行治疗。
那其中就有一项结核杆菌。
接下来就介绍一下结核杆菌抗体的测定结果。
目前，检测结核分枝杆菌的常见方法是直接涂片抗酸染色、痰结核菌常规培养和生物芯片蛋白技术。
与抗酸染色法、痰结核菌常规培养法比较，生物蛋白芯片技术具有检测速度快，敏感性和特异性高的特点。
对诊断结核杆菌感染、动态观察结核病患者的疗效有良好作用。
生物蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌抗体。
较敏感、特异性强又纯化的抗原为细胞壁的脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16kDa蛋白和38kDa蛋白。
LAM是构成结核分枝杆菌细胞壁的重要组成成分，其特异性强，能刺激结核感染者产生抗体;16kDa蛋白是有潜力的免疫诊断抗原;38kDa蛋白为脂蛋白。
其与细胞膜或菌体表面的脂肪结构相连。
对小儿来说，只要感染过结核菌，结核抗体试验就呈阳性反应，它只是诊断结核感染的一个参考，不能说一定就是结核病。
国人大多年长儿及成人感染过结核菌，绝大多数人是不发病的。
这和儿科结核菌素试验(PPD)检查一样，也是诊断结核病的一个参考，结核菌素试验是在皮内注射0.1ml的药液，48-72小时看结果，PPD试验也只有强阳性(需配合临床表现和胸片等其他检查)才有意义。
如呈阴性反应，就说明没感染结核菌;弱阳性和阳性反映，也只能说明感染了结核菌，不能确诊为结核病。
临床发现，LAM、38 kDa抗体检出率可能与年龄增加、机体抵抗力或免疫力下降有关。
其结果随结核病患者的年龄增加而升高，因此采用生物蛋白芯片技术联合检测3种结核抗体，可提高其诊断结核的敏感性和特异性，也可作为结核病的血清学诊断方法之一。
研究证实，门诊及住院结核病患者痰抗酸染色阳性患者的LAM、16 kDa、38 kDa抗体检出率均较高，而经过治疗的患者的3种结核抗体检出率均较低。
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理检测原理是：机体感染结核分枝杆菌后，存在于血液中的特异性效应T淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌特异抗原时，产生和分泌IFN-γ，通过检测能够释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，用于结核分枝杆菌感染及结核病的辅助诊断。
该检测方法相对于结核菌素试验，具有更高的特异性。
由于结核菌素试验中用的结核菌素是从结核分枝杆菌中提取的非种属特异的性分子，因此存在与卡介苗（BCG）的交叉，接种过BCG的人群即使没有感染结核也可能会出现结核菌素试验阳性。
而ELIspot检测所用的结核分枝杆菌特异抗原与BCG抗原无交叉，不受BCG接种的影响，未接种BCG和接种BCG的人群均可用该法进行结核病感染的筛查和结核病的辅助诊断。
目前应用的ELIspot检测试剂盒是由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT®TB试剂盒。
其检测方法如下：1.抗体包被将适量人IFN-γ抗体预先包被于96孔ELIspot板上。
2.标本采集及准备采集8小时内的肝素抗凝血，用Ficol离心分离外周血单核细胞（PBMC），用细胞培养液洗涤2次后，重悬于细胞培养液中。
3.细胞计数及稀释用台盼蓝染色计数法对PBMC细胞悬液计数，将细胞悬液浓度调整至2.5×105个细胞/100μl。
4.抗原刺激及孵育每个待检样本均需设阳性对照孔、阴性对照孔和检测孔。
阳性对照孔加入植物血凝素（PHA）作为阳性刺激抗原，阴性对照孔不加任何抗原刺激，检测孔加入结核特异性抗原。
若有几个特异性抗原进行分别刺激，检测孔可根据需要设置多个孔。
向阳性、阴性对照孔及检测孔内各加入100μl的PBMC细胞悬液，将ELIspot板置于37℃5%CO2培养箱内静置孵育16～20小时。
孵育期间不能移动ELIspot板，必须保证板静置不动。
5.斑点显色及计数弃除板内的细胞培养液，每孔加入200μl的PBS缓冲液洗涤3～5次，弃净板内的液体，向每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，37℃孵育1小时。
《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》(2024)要点
《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》（2024）要点1 TB/HIV双向筛查技术手段1.1 在HIV感染者/AIDS患者中开展活动性TB/结核感染筛查目前WHO推荐用于HIV感染者/AIDS患者活动性TB筛查的方法有TB症状筛查、CXR、C-反应蛋白（CRP）检查、尿脂阿拉伯甘露聚糖抗原侧流（LF-LAM）免疫检测以及MTB 分子快速诊断方法。
我国工作实施方案中还要求对于HIV感染者/AIDS患者定期进行TB 病原学检查。
1.1.1 TB症状筛查我国对于感染HIV病毒的人群（PLHIV）的TB症状筛查主要基于门诊随访时的问卷调查，筛查症状包括：咳嗽、咳痰持续2周以上；痰中带血、反复发热持续2周以上；反复夜间出汗、无法解释的体重明显下降、经常容易疲劳或呼吸短促、淋巴结肿大。
1.1.2 胸部影像学检查胸部影像学检查是筛查、诊断或排除活动性肺结核的重要手段之一。
胸部影像学检查包括CXR、胸部CT断层扫描等，是普及性较广的一种检测手段。
1.1.3 TB细菌学检查TB细菌学检查是诊断活动性肺结核的重要检测方法，主要包括痰涂片和痰培养，临床上广泛用于一般人群肺结核的诊断和鉴别诊断。
目前尚无其他检测手段能代替痰培养作为TB实验室确诊的“金标准”。
1.1.4 快速分子生物学检查随着核酸检测技术的迅速发展，快速分子生物学检测已广泛应用于TB诊断，国外研究显示其在HIV感染者/AIDS患者中开展结核筛查也具有较高的灵敏度和特异度。
1.1.5 CRP检查CRP是一种非特异性的炎性标志物，与机体的感染或应激状态相关。
CRP检测简便、价廉、易操作，是POCT的常用项目，普及性高。
1.1.6 LF-LAM免疫检测我国尚未引进该项技术。
1.1.7 结核感染检查WHO和我国推荐用于HIV感染者/AIDS患者LTBI筛查的方法有结核菌素皮肤试验（TST）、γ-干扰素释放试验（IGRA）和基于结核分枝杆菌抗原的皮肤试验（TBST）。
结核分枝杆菌耐药检测技术选择——分子线形探针方法
2
1、单耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对 一种一线药物抗结核药物耐药。 2、多耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对 不同时包括异烟肼、利福平在内的一种以上的一线抗 结核药物耐药。 3、耐多药（MDR－TB）：结核病患者感染的结核杆 菌体外被证实至少对异烟肼、利福平耐药。
2222
核酸DNA提取-痰
6%NaOH和2.94%枸橼酸钠等体积混合，配制 1%NALC前处理液。 取2ml涂阳痰标本转移到50ml离心管，加1-2倍体积前 处理液，振荡30s,静置15分钟。 加PBS到45ml，3000g离心20min。 倒掉上清，加2ml PBS混匀沉淀，分别取1ml转移到 1.5ml离心管。 取1支管12000rpm离心5min，吸弃上清。
3
耐药结核分枝杆菌机制
基因突变
结核分枝杆菌产生耐药性的主要原因
药物外排泵的影响
结核分枝杆菌细胞壁结构的改变
4
耐药产生的主要原因
微生物上，耐药性是基因突变引起药物 对突变株的效力降低造成的。 临床及管理上，不足够的或不恰当的治 疗导致结核病患者体内的耐药突变株变 成优势株。
5
中国耐药流行情况
如果不能立即实验，-20度保存。
2525
PCR扩增
每个病例取5ul DNA样本到扩增混合液中
2626
PCR扩增
痰标本和菌株用不同程序
培养标本 15 min 95℃ 30 sec95℃ 2min58℃ 25 sec 95℃ 40 sec 53℃ 40 sec 70℃ 8 min 70℃ 4℃ 24 h 1 个循环 1 个循环 20 个循环 30 个循环 1 个循环 10 个循环 直接病人标本 1 个循环 10 个循环
结核分枝杆菌镜检执行标准(一)
结核分枝杆菌镜检执行标准(一)
结核分枝杆菌镜检执行标准
引言
•结核分枝杆菌镜检是一种常用的结核病的检测方法，能够快速、简便地检测结核分枝杆菌的存在。
•为了确保该检测方法的准确性和可靠性，制定了一系列的执行标准。
标准内容
1.标本采集标准
–根据结核病患者的症状及体征，采集合适的标本进行检测。
–标本采集应遵循无菌技术，避免污染或交叉感染。
2.标本处理标准
–获得标本后，要迅速进行处理，确保标本中的结核分枝杆菌数量不发生明显变化。
–标本的处理应遵循严格的操作规程，防止污染和误诊。
3.染色方法标准
–使用适当的染色方法对标本中的结核分枝杆菌进行染色，以便于观察和鉴定。
–染色方法应符合相关的规范，并在操作过程中保持稳定且一致。
4.显微镜检查标准
–使用显微镜对染色后的标本进行观察和检查。
–操作人员应具备一定的显微镜操作技巧和解读能力，保证结果的准确性。
5.结果判读标准
–对观察到的结核分枝杆菌进行判读，并进行相应的结果记录。
–结果判读应由专业人员进行，避免误判和误诊。
总结
•结核分枝杆菌镜检的执行标准对于准确检测结核病起着重要的作用。
•只有严格遵守执行标准，才能保证结果的准确性和可靠性，提高结核病的早期诊断率。
•各医疗机构和从业人员应加强对执行标准的学习和培训，确保标准的全面贯彻。
几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法
肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。
菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。
大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。
目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。
近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。
筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。
目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。
结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。
实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。
近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。
目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。
主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。
传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。
离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。
分枝杆菌检测方法总结
分枝杆菌检测方法总结分枝杆菌检测方法主要有以下几种：1. 痰涂片：这是最常用的方法，优点是快速、低廉、操作简便，但无法区分死活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌（MTB）和非结核分枝杆菌（NTM），而且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低，漏检率很高。
2. 结核培养：与痰涂片相比，培养法灵敏度增加了不少，结核培养阳性是诊断抗酸杆菌的金标准，但缺点在于培养时间周期过长，一般需要8周左右时间，这样很耽误医生用药和患者及时治疗。
3. 结核杆菌IgG抗体检测：感染结核分枝杆菌后，体内可产生特异性抗体。
将结核分枝杆菌抗原包被在固相载体上，与待测血清反应，血清中相应的抗体可结合于其上，再以胶体金（或酶）标记，显示反应，可检出血清中结核分枝杆菌抗体。
结核杆菌IgG抗体检测特异性较好，对于排除结核阳性有利，但无法确诊活动性结核。
4. Xpert MTB/RIF：通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现MTB核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。
具有以下优势：特异性好，能准确区分MTB和NTM；灵敏度高，检测快速，仅需要两个小时就完成检查了；适用于各种标本，痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高，可及时为临床用药提供有效参考。
5. IGRA：γ-干扰素释放试验（IGRA）是检测结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素（IFN-γ），以判断是否存在MTB感染。
IGRA适应证主要包括结核潜伏感染（LTBI）的诊断和活动性结核（ATB）的辅助诊断。
与结核菌素皮肤试验（TST）相比具有明显优势：特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌（NTM）的干扰；使用单一阈值作为阳性判断标准；作为体外诊断方法，更适用于疫情检测和流行病学调查。
IGRA是世界卫生组织（WHO）推荐的用于诊断MTB感染的体外免疫学方法。
结核分枝杆菌的核酸检测
结核分枝杆菌的核酸检测结核病是一种由结核分枝杆菌引起的严重传染病，对人类健康构成了重大威胁。
准确、快速地检测结核分枝杆菌对于结核病的诊断、治疗和防控至关重要。
在众多检测方法中，核酸检测技术凭借其高特异性和敏感性，成为了结核病诊断的重要手段。
一、什么是结核分枝杆菌核酸检测结核分枝杆菌核酸检测是一种通过检测样本中结核分枝杆菌的核酸（DNA 或 RNA）来确定是否存在感染的方法。
核酸是生物体遗传信息的携带者，每种生物都有其独特的核酸序列。
结核分枝杆菌也不例外，通过检测其特有的核酸片段，可以准确地判断样本中是否有这种病原菌的存在。
二、核酸检测的原理常见的结核分枝杆菌核酸检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、荧光定量 PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）等。
以 PCR 为例，其基本原理是先从样本中提取核酸，然后利用特定的引物（一小段与目标核酸序列互补的 DNA 片段），在 DNA 聚合酶的作用下，经过多次循环的变性、退火和延伸过程，使目标核酸序列得到大量扩增。
扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳、荧光检测等方法进行检测和分析。
荧光定量 PCR 则是在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光标记的探针，随着 PCR 反应的进行，荧光信号不断累积，通过实时监测荧光信号的变化，可以实现对核酸的定量检测。
LAMP 技术则是利用一种特殊的酶和引物设计，在恒温条件下就能快速扩增目标核酸，具有操作简便、快速的优点。
三、检测样本的类型结核分枝杆菌核酸检测的样本类型多样，常见的有痰液、支气管肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、血液等。
痰液是最常用的样本之一，对于肺结核患者，痰液中往往含有较多的结核分枝杆菌。
但对于一些不排痰或排痰困难的患者，如儿童、肺外结核患者，就需要采集其他类型的样本。
支气管肺泡灌洗液对于肺部病变部位的检测具有较高的准确性。
胸水和脑脊液则常用于结核性胸膜炎和结核性脑膜炎的诊断。
血液样本常用于检测潜伏性结核感染。
四、核酸检测的优势1、高特异性：能够准确识别结核分枝杆菌特有的核酸序列，减少误判。
结核杆菌检测：从涂片、培养到T-SPOT，再到核酸
结核杆菌检测：从涂片、培养到T-SPOT，再到核酸肺结核是一个人人谈之色变的传染性疾病，传染性极强，可通过空气中的飞沫传播至他人。
当一个感染者咳嗽或打喷嚏时，周围的人很容易接触到携带病原体的飞沫，进而感染结核分枝杆菌。
结核杆菌检测是为了及早发现和诊断结核病，防止其传播和控制疫情的蔓延。
目前许多人对结核杆菌检测了解的并不多，下面我们来聊一聊这方面的知识，让更多的人来认识和了解它。
一、涂片法涂片操作是结核杆菌检测中的一项重要步骤，可以帮助明确是否存在结核杆菌感染。
由于结核杆菌主要通过呼吸道传播，痰液中往往含有较高浓度的结核杆菌，所以痰液是最常用的标本。
在进行涂片操作之前，需要准备好干净的玻璃片和玻璃杯，以及标准的染色试剂，如抗酸染色试剂和碱性染色试剂。
此外还需要一支细胞刮取棒或细胞刮取刷，用于采集患者的痰样液。
接下来将玻璃片放入玻璃杯中，倒入适量的痰样液。
使用细胞刮取棒或刷子，将痰样液均匀地涂抹在玻璃片上，确保涂片的厚度均匀一致。
然后将涂片晾干。
涂片晾干后，便可以进行染色，抗酸染色是常用的染色方法之一，它可以将结核杆菌染成红色，而其它细菌则染成蓝色。
二、培养法培养法是结核杆菌检测中一种常用且可靠的方法，用于检测结核病的存在和病原体的生长。
培养法的操作步骤为：先从患者的痰液中采集样本，并尽快送到实验室进行处理，以保证样本的新鲜度。
接下来，对采集到的样本进行稀释，这样做的目的是为了减少样本中的其它细菌和微生物的干扰。
通常稀释的方法是将样本与生理盐水混合，以达到适当的浓度。
之后将稀释后的样本接种到含有适当培养基的培养皿中，培养基通常包含有利于结核杆菌生长的营养物质。
接种时操作人员应该尽量避免污染，以确保只有结核杆菌生长在培养皿中。
上述操作完成后，需将培养皿密封，并置于恒温培养箱中。
结核杆菌通常在37摄氏度下生长，所以恒温箱的温度应设定为适当的温度。
在培养过程中操作人员应定期观察培养皿的变化，以检测结核杆菌的生长。
结核分枝杆菌实验室检测方法
高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的效果评价.实用检验医师杂志，2012，4（3）：157-160.
五种结核检测方法效果评价
结核组：1260例
非结核组：100例
改良罗氏培养
荧光PCR
涂片法
萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍）
3
涂片镜检--抗酸染色
联染法：敏感性高，特异性好，速度快！
敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条菌时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
04
不能区分活菌和死菌
抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（红球菌属）、Legionella micdadei（军团菌）、cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora（等孢球虫）等有抗酸菌特点
1
结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌
2
结核分枝杆菌群
偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等
偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种属于迅速生长型，鸡蛋培养基上3-5天可见菌落
发光二极管荧光显微镜（LED）
结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可靠方法．
传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。
结核杆菌的检测方法
结核杆菌的检测方法结核病是一种由结核杆菌引起的严重传染病，对人类健康造成了巨大威胁。
早期、准确地检测出结核杆菌对于结核病的诊断、治疗和控制至关重要。
下面我们就来详细了解一下结核杆菌的检测方法。
一、涂片镜检法涂片镜检法是最常用的结核杆菌检测方法之一。
通过采集患者的痰液、脓液、脑脊液等标本，经过涂片、染色处理后，在显微镜下观察是否有抗酸杆菌。
这种方法简单、快速、成本低，但敏感性相对较低，容易出现漏诊。
而且，它无法区分结核杆菌和其他非结核分枝杆菌。
二、细菌培养法细菌培养法是检测结核杆菌的金标准。
将标本接种到特定的培养基上，在适宜的条件下培养，观察是否有结核杆菌生长。
培养法的优点是准确性高，能够确定菌株的类型和药敏情况，为治疗提供依据。
但培养周期较长，通常需要 2 8 周，不利于早期诊断。
三、分子生物学检测法1、聚合酶链反应（PCR）技术PCR 技术通过扩增结核杆菌的特定基因片段来检测结核杆菌。
具有敏感性高、特异性强、检测速度快等优点，能够在短时间内得出结果。
但 PCR 技术对实验条件和操作人员要求较高，容易出现假阳性和假阴性结果。
2、基因芯片技术基因芯片技术可以同时检测多个结核杆菌的基因靶点，实现快速、高通量的检测。
它能够对结核杆菌进行菌种鉴定和耐药基因检测，为临床治疗提供更全面的信息。
四、免疫学检测法1、结核菌素皮肤试验（TST）TST 是通过在皮内注射结核菌素，观察皮肤反应来判断是否感染结核杆菌。
但 TST 结果易受卡介苗接种和其他分枝杆菌感染的影响，特异性不高。
2、结核抗体检测检测患者血清中的结核抗体，判断是否感染结核杆菌。
但抗体检测在结核病早期和免疫功能低下的患者中敏感性较低。
五、影像学检查胸部 X 光和 CT 检查可以发现肺部的结核病灶，如渗出、增殖、干酪样坏死、空洞形成等。
但影像学检查不能直接确诊结核杆菌感染，需要结合临床症状和其他检测方法进行综合判断。
六、其他检测方法1、噬菌体生物扩增法利用噬菌体对结核杆菌的特异性感染和扩增来检测结核杆菌，具有操作简便、快速的特点。
结核分枝杆菌分子生物学检测技术介绍
2
交叉引物设计
5’
置换引物
3’ 5’
交叉引物 1
交叉引物 2
5’ 3’
置换引物 5’
BST DNA 聚合酶 具有链置换功能
全封闭式核酸扩增产物快速检测装置
免疫层析显色法技术：核酸检测试纸条包被上特异性的核酸纳米级胶体金颗粒和特 别标记的核酸探针，使扩增后的检测产物和胶体金颗粒结合，在试纸条的检测线 （T线）上显色来检测DNA扩增产物；如果无目标DNA，特异性探针则将无法把扩 增产物与标记物连接，结果无显色。
广州迪澳LAMP
三种LAMP检测试剂盒比较
荣研
华峰
迪澳
样品前处理及 简易装置进行痰标本 手工痰标本液化处理，手工痰标本液化处理，
核酸提取
前处理及核酸提取 煮沸法提取核酸
煮沸法提取核酸
反应温度/时间
67℃/40min
65℃/60min
63℃/30min
操作流程
装置提取核酸后直接 加入到反应管进行扩 增反应。
分子生物学检测技术主要分类
PCR技术：通过控制温度的变化来实现DNA扩增，包括模板变性 （95℃）、 引物杂交（58℃）和DNA合成（72℃） 。
恒温扩增检测技术： DNA在60 ～ 65℃处于动态平衡状态，任何一个引物 向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单 链。
闭扩增产物。
产物。
产物。
是
否
是
交叉引物恒温扩增检测（CPA）
模板序列和交叉引物设计
生物素标记探针
5’AGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATG3’
结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法）规程操作
结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法）规程操作结核分枝杆菌抗体检测(胶体金法) 规程操作1、检验目的本试剂盒可定性检测人血清中结构分枝杆菌抗体，用于临床结构病的辅助诊断。
2、检验原理本试剂盒利用斑点免疫胶体金渗滤技术（DIGFA），将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维素膜上，膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核IgG 抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物标呈色（SPA能与IgG 特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳结果从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。
3、样本要求必须使用新鲜血清标本，血浆标本必须用玻璃棒剥离纤维蛋白，保证血清无混浊沉淀。
4、试剂4.1试剂名称：结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法）4.2生产厂家：上海奥普生物医药有限公司4.3包装规格：20人份/盒4.4贮存条件及有效期：2-8℃干燥处保存，有效期12个月。
5、检验方法：5.1在反应板的反应孔中间，加入2滴封闭液，等待薄膜吸入；5.2 取40μl新鲜的血清标本，加入反应孔中间，等待薄膜吸入；5.3 在反应孔中间加入6滴洗活液，等待薄膜吸入；5.4 在反应孔中间加入2滴金标液，等待薄膜吸入；5.4 在反应孔中间加入6滴洗涤液，等待薄膜吸收，目测结果；6、结果判断6.1 阳性——质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现。
6.2 阴性——质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹。
检验方法的局限性少数标本（急性感染、高血脂、溶血等）可出现背景偏红，一般不影响结果判断，可通过将标本用封闭液1:3稀释，加样80μl背景将获得改善。
严重乳糜血标本可能会阻塞硝酸纤维素膜孔，使背景很红，影响中间红色斑点有无的判别，不宜用本法测定。
7、注意事项7.1 必须以单人份操作，严禁多标本同时检测，每个标本的操作步骤需要连续进行，不宜停顿过长。
7.2 质控点显示红色表明试剂盒有效；阴、阳性对照也是确保定性结果可靠的一个环节，但临床阳性标本显色深浅可以与阳性对照不同。
聚合酶链反应检测结核分枝杆菌
聚合酶链反应检测结核分枝杆菌结核分枝杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大。
近几年结核杆菌的变异性较大，对抗结核药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高。
虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些患者亦可造成误诊或漏诊；动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要。
近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点。
另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交。
该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及放射性核素操作之嫌等，因而近来已较少应用。
上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势。
近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核（TB）的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室。
应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物，该引物所引导的DNA扩增序列应是结核分枝杆菌独有的，且是结核分枝杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性。
一、标本的采集（一）痰液标本的收集1.患者清晨刷牙漱口。
2.用力咳出气管深部第一口痰于一次性干燥无菌的50ml带盖痰杯内，1小时内送检。
3.对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出。
4.小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
精品课件
一般临床结核检测方法
• 1.结核的常规检测 • 2.Y-干扰素 检测技术 • 3.T-SPOT.TB检测技术 • 4.GeneXpert检测技术
精品课件
1.常规检测检测
精品课件
精品课件
谢谢！
No Image
精品课件
➢ 无交叉反应 ，故也适用于BCG接种的病人或感染非结核之 病人.
➢ 高特异性及敏感度.(>80%)
精品课件
优势
➢ 可做非肺部结核病检验 ➢ 建立一个快速且精确的检验方法（5-15分钟判读
结果） ➢ 广泛用于一般人群普查（早期诊断，早期治疗） ➢ 可做为培养确认试剂是否为结核分枝杆菌(MTB)或
非结核分枝杆菌(NTM)之区别 ➢ 评价结核临床疗效及治疗方案 ➢ 定位：筛查
精品课件
2.Y-干扰素
原理：利用T细胞对结核菌的记憶,加入结核菌抗原,产
生干扰素的多寡.判定是否为潜伏感染者.
检测标本：血液（目前WTO已禁止使用 血液标本检测）
缺
收费标准：500-800元
点
适用于高危险人群检测. 不宜用于普 查.
操作复雜.需要专业人员及设备.
精品课件
3.T-SPOT.TB（体外酶联免疫斑点技术）
精品课件
非結核分枝桿菌 -
結核分枝桿菌 +
結核菌快速金標檢測試劑盒 簡易操作步驟
精品课件
精品课件
优势
➢ 检测结核菌分枝杆菌之特异性分泌性抗原 (Secreted specific protein )
➢ 可取代耐酸染色无法区别分枝(MTB)或非分枝结核(NTM)杆 菌之困扰.
➢ 取代现行的非特异性纯化蛋白抗原 (PPD, purified protein derivative).
操作复杂 繁琐
缺 点
三甲大型实 验室操作
收费价格： 500-800元
精品课件
4.GeneXpert检测技术
• 原理：分子生物检测技术
收费标准：约500元
缺
点
配合仪器使用，仪器需约100万元
目前普及范围小
精品课件
检出率低、费用低
检出率高、费用高
费用低、检出率高
精品课件
结核检测新技术
——结核菌分泌蛋白抗原快速检测试剂
精品课件
结核菌分泌蛋白抗原快速检测试剂（胶体金法）
原
理
敏感性 81%
是利用重组基因的技术制造结核菌的特异 性蛋 白（抗体），纯 化后包被吸附于胶 体金上，检测时，当样品有结核菌分泌性 蛋白时，先和包被的胶体金标记物结合， 产生反应。由于层析作用，其反应复合物 会沿着硝酸纤维膜向前移动。
特异性
精品课件
精品课件
注意事項
➢ 服药治疗的结核病人, 可能会因为药物抑制蛋白分泌, 所以成阴性結果 .
➢ 若是药物治疗的結核病人,进行疗程中追踪检测,成阳性反应. 应考虑可 能为抗药性病患.
➢ 对于痰液的检测, 必須使用未处理的原痰, 加入试剂盒中的样品缓冲液 后方可检测. 若是使用高浓度及高碱性的 NaOH 软化痰液, 则将破坏试 纸条中的包被抗体和胶体金, 导致错误結果.
精品课件
2014年全国法定法定传染病发病率
精品课件
煤矿行业结核比率
• 据北京京煤集团总医院结核病科孔冬青主任调查，肺结核 科住院治疗的611例煤工尘肺合并肺结核患者，经筛查， 检出痰菌阳性223例。即三分之一的人均患有肺结核。该 数据逐年递增。
精品课件
危害
精品课件
WHO对结核个案定义
• 疑似结核个案 –有呈现结核病征与症状（低烧、全身乏力或消瘦、夜 间盗汗、女性可导致月经不调或停经） –长期咳嗽超过2周
➢ 试剂盒中的样品缓冲液可以破坏菌体的蛋白酶, 使菌体失活, 但是不影
响试验結果及检测.
精品课件
胶体金免疫数字测试卡
精品课件
HR201全自动金标分析仪
特点： 定性和模拟定量检测 触控界面、操作简单 体积小、便于携带 快速精确（10秒出判读结果） 数据储存量大 内置热敏打印机 可实时打印检测结果 支持LIS系统
85.9%
痰液检测结核杆菌 染色与TB抗原快速检测试剂之比较
痰液耐酸性染色
濟南杏恩 結核菌檢測試劑盒
痰液(未經處理)
樣品緩衝液
結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 -
結核分枝桿菌+
培養確認
固態觀看 PCR 全自動化培養儀
濟南杏恩 結核菌檢測試劑盒
培養確認
結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 -
结核分歧杆菌检测新技术
——结核菌分泌蛋白抗原快速检测
精品课件
我国流行概况
➢ 是全球22结核病高负担国家之一 ➢ 活动性肺结核病人数居世界第二，仅次于印度 ➢ 是我国重点控制疾病之一 ➢ 目前估算全国活动性肺结核病人450多万，每年新发传
染性肺结核患者150多万 ➢ 全国约45%的人受过结核菌的感染，明显高于全球水平