黄秋葵多糖结构分析及细胞毒性研究_闵莉静

０．１００、０．２５０、０．５００和１．０００ｍｇ／ｍＬ 的 溶 液。 每 孔 加 入
上述溶液各 ０．１５ ｍＬ，４ 复 孔。 糖 液 与 细 胞 共 培 养 ２４ｈ
后，吸去 旧 的 培 养 液，每 孔 加 入 １００μＬ 含 ５．０μｇ／ｍＬ
ＭＴＴ 的无血清 ＤＭＥＭ（５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ １０．０ｍＬ 加入
到９０μＬ ＤＭＥＭ 中），３７℃培养４ｈ。翻板法弃去液体，
每孔加入１００μＬ ＤＭＳＯ，震荡１０ ｍｉｎ。在酶标检测仪
上，５７０ｎｍ 波长处测定 ＯＤ值。同时作好细胞全活对照
和细胞全死对照，均为６复孔。
细胞 存 活 率 （％）＝ （Ｘ －Ｘ０％ ）／（Ｘ１００％ －Ｘ０％ ）×
１００％
（３），
其中，Ｘ：糖液共培养后测定的 ＯＤ 值；Ｘ０％ ：细胞全
２７．９１ ２８．３２ ２８．２３
平均值 ／％
２８．１５
２．２ 凝胶渗透色谱（ＧＰＣ）测定黄秋葵多糖分子量 由图１可以看出，经过柱处理后的黄秋葵多糖馏分
纯度较高，在ｔＲ６．１９４ｍｉｎ处有１个峰，根据葡聚糖标准 曲线计算，该峰对应分子量约为１９１ ８３８．９Ｄａ。
图 １ ＧＰＣ 测定黄秋葵多糖分子量谱图 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｏｋｒａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＧＰＣ ｓｐｅｃｔｒａ
现从黄秋葵种子中提取天然黄秋葵多糖，并经过柱 纯化、酸水解，研究其单糖组成；并对黄秋葵多糖的细胞 毒性进行了研究，以期为黄秋葵多糖的深度开发提供试 验依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 供试黄秋葵种子购自当地农贸市场；蒽酮、硫酸、三
氟乙酸、甲醇、乙腈均为分析纯（双林化学试剂厂）；葡聚 糖、鼠李糖、Ｄ－木糖、木糖醇、岩藻糖、Ｄ－果糖、Ｄ－葡萄糖、 半乳糖、甘露 糖 均 为 标 准 品 （上 海 西 宝 生 物 科 技 有 限 公 司）；Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＨＷ－４０Ｃ（日本 ＴＯＳＯＨ 公司）；甲基噻唑 基四唑 （ＭＴＴ）、胰 蛋 白 酶 均 购 自 Ｓｉｇｍａ－Ａｄｒｉｃｈ 公 司； ＤＭＥＭ（高糖）培养基购自吉诺生物有限公司；小牛血清 （ＦＣＳ）均 购 自 杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司。 ＳＭＭＣ－７７２１细胞（肝癌细胞）培养于含有１０％小牛血清 的１６４０培养基中，由浙江大学肿瘤免疫所赠送。磷酸缓 冲液 （ＰＢＳ）溶 液：８．０ｇ ＮａＣｌ，３．４７８５ｇ Ｎａ２ ＨＰＯ４ · １２Ｈ２Ｏ，２．９ｇ ＮａＨ２ＰＯ４，０．２ｇ ＫＣｌ，０．２ｇ ＫＨ２ＰＯ４ 溶 于 １ ０００ｍＬ蒸馏 水；ＭＴＴ 溶 液：５ ｍｇ／ｍＬ 甲 基 噻 唑 基 四 唑×ＰＢＳ液，过滤除菌，避光，２０℃保存。主要仪器：透析 膜（ＭＷ８ ０００～１４ ４００）购自 Ｐｉｅｒｃｅ公司；ＦＤ－１冰冻干燥
北方园艺２０１３（１４）：１６７～１７０
·中草药·
黄秋葵多糖结构分析及细胞毒性研究
闵 莉 静，李 敬 芬
（湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 ３１３０００）
摘 要：以黄秋葵种子为试材，用水煮醇沉法提取黄秋葵多糖并纯化，研究分析了黄秋葵多 糖的组分与结构，并对黄秋葵多糖的细胞毒性进行了研究。结果表明：通过提取得到的天然黄秋 葵多糖中糖含量为２８．１５％，其主要有鼠李糖、阿拉伯糖、Ｄ－木糖、Ｄ－果糖及 Ｄ－葡萄糖等几种单糖 成分；细胞毒性试验表明，黄秋葵多糖与葡萄糖的细胞毒性相近，属于低毒材料。
１．２ 试验方法
１．２．１ 黄秋葵多糖的提纯 取黄秋葵果实若干，加水浸
泡，１００℃回流４ｈ（×４），过滤，取滤液，合并滤液，浓缩，
滴加乙醇（ｖ∶ｖ＝１∶３），４ ０００ｒ／ｍｉｎ离心，取沉淀，加水
透析（ＭＷ ：８ ０００～１４ ４００）４８ｈ，４ ０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上
清，烘 干 得 粗 品，将 粗 品 溶 于 水 后，过 柱 （Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＨＷ－４０Ｃ），冻干成淡黄色粉末［３］。
死对照 ＯＤ值；Ｘ１００％ ：细胞全活对照 ＯＤ值。
２ 结果与分析
２．１ 蒽酮－硫酸法测定黄秋葵多糖含量 由表１可知，样品溶液吸光度值随多糖浓度的变化
呈线性关系，用 外 标 一 点 法 测 定 样 品 中 的 多 糖 含 量，约
为２８．１５％，且平行性较好。 表１ 蒽酮－硫酸法测定黄秋葵多糖含量
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｏｋｒａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｉｔｈ
１０ｍｉｎ。以蒸馏水作空白，于６２１ｎｍ 处测吸光度，作标准
工作曲 线，用 最 小 二 乘 法 得 回 归 方 程 为：Ａ＝０．００９３Ｃ＋ ０．０３１２（Ｒ２＝０．９７７９）［４］。由于吸光度值随糖浓度的变化
呈线性，所以 可 以 用 外 标 一 点 法 测 定 样 品 中 的 糖 含 量，
如下：
Ａ标准点／Ａ样品点 ＝Ｃ标准点／Ｃｘ
ａｎｔｈｒｏｎｅ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ
编号
标准点 １ ２ ３
原液浓度 ／μｇ·ｍＬ－１
３０ １８８ １８８ １８８
吸光度值 （Ａｂｓ） ０．２１４２ ０．３７４７ ０．３８０２ ０．３７９０
多糖浓度 ／μｇ·ｍＬ－１
５２．４８ ５３．２５ ５３．０８
多糖含量 ／％
第一作者简介：闵莉静（１９８１－），女，硕士，实验师，研究方向为天然 产物的提纯与结构修饰。 收稿日期：２０１２－０３－０６
机（北京德天佑科技发展有限公司）；ＶＶ１８００ＰＣ 全扫描
紫外可见分光光度计（海美谱达仪器有限公司）；Ｔｈｅｍｏ
Ｆｏｒｍａ恒温摇床；Ｓｏｎｙ －８０℃冰箱；Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｉｔｉｓｋａｎ Ｍｋ３酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ公司）。
２．３ 多糖链的酸水解 由图２可知，保留时间２．４～２．９ｍｉｎ为 ＣＦ３ＣＯＯＨ
峰，４．９ｍｉｎ左右为 ＣＨ３ＣＮ 峰，在所有的多糖水解液中 不存在二糖，均为单糖。观察黄秋葵多糖水解系列图可 以发现，随百度文库 水 解 时 间 的 增 长，水 解 产 物 变 得 越 来 越 简 单，这可能是由于水解液中残留酸对水解产物具有降解 的破坏作用，尤其是在水解８ｈ后水解产物已经全部降
１．２．２ 蒽酮－硫酸法测定黄秋葵多糖含量 葡萄糖标准
曲线：精密称取０．０５ｇ葡萄糖标准品，纯净水溶解，定容 为０．５ｇ／Ｌ的葡萄糖标准溶液，作为储备液。分别移取
储备液配置成浓度为５、１５、４０、６０、８０μｇ／ｍＬ的系列标准 溶液。依次移取不同浓度的标准溶液 １．０ ｍＬ 于比色管
中，分别加入４．０ｍＬ ２．０ｇ／Ｌ 蒽酮－硫酸溶液，冰水浴， 加完后，同时放入沸水浴中１０ｍｉｎ，取出冷却，室温放置
２．４ 高效液相分析单糖组分
考虑到单糖 标 准 品 在 混 合 后 ，保 留 时 间 可 能 会 相
互影响 ，所以在 对 单 糖 标 准 品 单 个 进 样 测 定 保 留 时 间
的基础上 ，又混 合 进 样 测 定 各 单 糖 在 混 合 组 分 中 各 自
的 保 留 时 间（图 ４）。 由 于 在 黄 秋 葵 多 糖 酸 水 解 液 分 时
解。从整个过 程 看 来，对 于 黄 秋 葵 多 糖，水 解 条 件 选 择 应相对温和，水 解 时 间 不 宜 太 长，一 般 选 择 水 解 时 间 为 ２ｈ左右效果最好。对于在保留时间 １１～１３ ｍｉｎ 间 几 个 峰位移的变化，可能是 Ｄ－葡萄糖在稀酸的作用下，形成 烯醇负离子，进 而 转 变 为 果 糖、甘 露 糖 和 葡 萄 糖 的 混 合 物（图３）。
段取样采集数 据 中 ，发 现 各 成 分 保 留 时 间 存 在 粘 连 现
象，所以在单糖 组 分 分 析 中 ，在 流 动 相 中 添 加 了 甲 醇 ，
使流动相极性降低，各组分保留时间后移，其中保留时
图３ 葡萄糖、果糖和甘露糖烯醇化互变 Ｆｉｇ．３ Ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｆｒｕｃｔｏｓｅ ａｎｄ
（１），
糖含量（％）＝Ｃｘ／Ｃ原液 ×１００％
（２），
其中，Ａ标准点 ：标样的吸光度，单位：Ａｂｓ；Ａ样品点 ：样品
的吸光度，单位：Ａｂｓ；Ｃ标准点 ：标准点浓度，单位：μｇ／ｍＬ； Ｃｘ：样品中黄秋葵多糖浓度，单位：μｇ／ｍＬ；Ｃ原液 ：样品中 黄秋葵多糖表观浓度，单位：μｇ／ｍＬ。
精密称取黄秋 葵 多 糖 干 粉 若 干，加 水 溶 解，１００ ｍＬ
关键词：黄秋葵；多糖；结构；细胞毒性 中图分类号：Ｓ ６４９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００１－０００９（２０１３）１４－０１６７－０４
多糖是 来 源 于 高 等 植 物 细 胞 壁、动 物 细 胞 膜、微 生 物细胞壁 中 的 多 羟 基 高 分 子 化 合 物［１］。 多 糖 类 化 合 物 是当今世 界 上 仅 次 于 煤 炭、石 油 和 天 然 气 的 第 四 大 能 源［２］。植物多糖往往具有多种生理活性，而且由于其没 有细胞毒性，而成为研究热点［１］。黄秋葵多糖是从药食 兼用的植物—黄秋葵果实中提取的一种天然植物多糖， 具有降脂、降压、抗癌、抗热应激性、抗疲劳等生理活性［２］。
定容。移取１．０ｍＬ溶液按上述操作显色，于６２１ｎｍ 处
测吸光度。
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１．２．３ 凝胶渗透色谱（ＧＰＣ）测定黄秋葵多糖分子量 以分子量分别为１０ ５００、４３ ２００、７６ ９００、１８８ ０００Ｄａ的葡 聚糖标准品为标准点，ＧＰＣ 测定保留时间，作标准工作 曲线，用 最 小 二 乘 法 得 回 归 方 程 为：ｙ＝ －１．５３１９ｘ＋ ２１．６５３（Ｒ２ ＝ ０．９９５５）。 色 谱 条 件：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００， ＳＥＤＥＸ７５型蒸 发 光 散 射 检 测 器（ＥＬＳＤ），检 测 器 灵 敏 度：７，雾 化 温 度：５５℃，雾 化 压 力：３．０６ｂａｒ，色 谱 柱： Ｔｓｋ－ＧｅＬ ３０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ×３００ ｍｍ），柱温：３０℃， 流动相：水／Ｎ２，流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。 １．２．４ 多糖链的酸水解 准确称取黄秋葵多糖样品若 干，加入２．０ｍＬ ２．０ｍｏｌ／Ｌ 的 ＣＦ３ＣＯＯＨ，１１０℃，恒 温 油浴，回流２ｈ，每隔０．５ｈ取１次样，至３．５ｈ后，于水 解至 ８ｈ后 再 取 １ 次 样 。 取 出 的 水 解 液 于 ４５℃ ，低 压 浓 缩，ＨＰＬＣ 检 测 成 分。 色 谱 条 件：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００， ＳＥＤＥＸ５５型蒸 发 光 散 射 检 测 器（ＥＬＳＤ），检 测 器 灵 敏 度：５，雾 化 温 度：４０℃，雾 化 压 力：３．０ｂａｒ，色 谱 柱： ＨｙｐｅｒｓｉｌＮＨ ２５μｍ（４．６ｍｍ×２５０ ｍｍ），柱温：２５℃，流 动相：乙腈－水 （ｖ∶ｖ＝８２∶１８），流 速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，进 样 量：１０．０μＬ［５］。 １．２．５ 高 效 液 相 分 析 单 糖 组 分 色 谱 条 件：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００，ＳＥＤＥＸ５５型蒸发光散射检测器（ＥＬＳＤ），检测器灵 敏 度：５，雾 化 温 度：４０℃，雾 化 压 力：３．０ｂａｒ，色 谱 柱： ＨｙｐｅｒｓｉｌＮＨ２５μｍ（４．６ｍｍ×２５０ ｍｍ），柱 温：２５℃，流 动 相：乙腈－水－甲醇（ｖ∶ｖ＝８５∶１０∶５），流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ， 进样量：１０．０μＬ。 １．２．６ 黄秋葵多糖细胞毒性［６］ 将 Ｃｏｓ－７细胞接种到 ９６孔板上，５ ０００细胞／孔，培养２４ｈ。吸去每孔中旧培 养液，黄 秋 葵 多 糖 和 葡 萄 糖 标 准 品 在 含 １０％ＦＣＳ 的 ＤＭＥＭ 中分别配制成浓度梯度为０．０１０、０．０２５、０．０５０、
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图２ 黄秋葵多糖在不同水解时间取样色谱分析结果 注：水解时间依次为：ａ：２ｈ；ｂ：２．５ｈ；ｃ：３ｈ；ｄ：３．５ｈ；ｅ：８ｈ。
Ｆｉｇ．２ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｏｋｒａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｗａｓ ａ：２ｈ；ｂ：２．５ｈ；ｃ：３ｈ；ｄ：３．５ｈ；ｅ：８ｈ．