蛋白质多肽链氨基酸序列的测定
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Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基， 所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为 一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行 Edman降解测序。
五、鉴定每个肽段氨基酸 顺序
ABCDE
*ABCDE
部分水解
*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE
完全水解
*A,*A+B,……*A+B+C+D+E *A,*A+*B,……*A+*B*+*C+*D+ *E
羧肽酶A法 羧肽酶B法 羧肽酶C法
二硝基氟苯法(Sanger法）
2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链 N-端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍 生物（DNP-氨基酸）
氨基肽酶法
• 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多 肽链的N-端逐个地向里水解。
• 根据不同的反应时间测出酶水解所释 放出的氨基酸种类和数量，按反应时 间和氨基酸残基释放量作动力学曲线， 从而知道蛋白质的N-端残疾顺序
一、氨基酸组成
蛋白质经盐酸水解后成为个别氨 基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分 开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋 白质中的百分组成或个数。
二、末端测定的具体方法
二硝基氟苯法（DNP法） 肼解法 化学法 二甲基氨基萘磺酰氯法 （Dansyl-氯法） 还原成氨基醇法
酶解法
亮氨酸氨肽酶法 细胞外氨肽酶法
羧肽酶 CpA CpB CpC 来源 胰脏 胰脏 植物或微 生物 专一性 能释放除Pro、Arg、Lys外的所有 的C-端氨基酸 主要水解C-端为Arg、Lys的肽键 相当广泛，几乎能释放C-端的所有 氨基酸
还原成氨基醇法
• 多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4） 还原成α-氨基醇，用层析法可以鉴定氨 基酸种类。 • Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采 用此法。
蛋白质一级结构（primary structure）的测定
• 蛋白质测序的发展简史
自从1953 年Sanger首次完成胰岛素的 氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。 但是Sanger花费多年时间才基本搞清胰岛 素的一级结构，现在由于方法改进及自动 化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白 质的氨基酸序列问世。
氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端和羧基末端 为何种氨基酸
把肽链水解成片段
测定各肽段的氨基酸排列顺序 综合运用Байду номын сангаас种水解法分析肽段中的氨基酸顺序
测序前的准备工作
要求： 样品纯度：97%以上 相对分子质量：允许误差在10%左右 （一）多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质 中的亚基。 如果多肽链间通过共价键（S—S）连接在一起，可采用氧化剂或还 原剂将其断裂。 （二）测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即 可确定多肽链的数目。 （三）二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸 胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后 用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。
C-末端之肼解法
• 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链 上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物 能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基 酸分离。 • 肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被 破坏而不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸
羧肽酶法
• 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地 水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基 酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-端残疾顺序
反向遗传法分析多肽链的氨基酸序列
基本原理：中心法则 基本步骤： 1、分离编码蛋白质的基因 2、测定DNA序列 3、排列mRNA出序列 4、按照三联密码原则推演氨基酸序列
为什么进行蛋白质测序?
基因组测序,为了破译遗传密码.现在密码已破,那进行蛋白质组测序有必要
吗? 基因研究贯穿了整个20世纪,100多年里,双螺旋结构的提出,中心法则的发 现,直至基因组的重大突破,使基因研究达到了前所未有的深度与广度. 然而,基因只是信息的携带者,蛋白质才是执行者.基因组计划有其固有的局限性, 基因组测序是否正确,要从其表达的蛋白来验证,否则,只是一堆乱码而已.3.5万 左右基因中一半以上是理论推断,需要从蛋白质角度确认.而且,从蛋白质研究的 自身发展来看,我们无法逃避蛋白质组表达谱分析,只是时间问题而已. 以前,对蛋白质的研究是优于基因的,因为PCR,测序自动化使其发展猛.80 年代末,Hillen Kamp发展的激光解析质谱,Fem J设计的电喷雾质谱可以高效,精 确的测量生物大分子的质量,并测定部分序列,进而用于数据库的检索.Mann M 等再此基础上通过建立"肽质量指纹图谱与肽序列标签"等技术实现了质谱对蛋 白质进行大规模准确快速自动化的测序. 结构生物学是生命科学领域又一个新的研究热点，飞速发展的蛋白质结构 分析技术是研究蛋白质功能的基础。随着蛋白质组时代的来临，许多基因组分 析留下的悬而未决的问题，可能通过直接的蛋白质的分离和鉴定而得到解决。
三、水解肽链成肽段
水解酶或化 水解部位 学试剂 胰蛋白酶 羧基侧 作用的氨基酸 赖氨酸、精氨酸 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色 氨酸和酪氨酸） 甲硫氨酸
胰凝乳蛋白 羧基侧 酶 溴化氰 羧基侧
•水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离 纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。
四、 Edman降解法测定肽 段的氨基酸序列
DNFB
肽段经过分离纯化后， 即可进行氨基酸测序。但是 获得数据之后，还不能得出 整条多肽链的氨基酸排列顺 序，因为尚不清楚这些片段 在多肽链中的先后次序。一 般需要用到多种水解法，并 分析出各肽段的氨基酸顺序， 然后经过组合排列对比，最 终得出完整肽链中的氨基酸 序列。
六、确定肽段在多肽链中 的次序
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错 重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 • — — — — — — — — — — — 多肽
• 氨基酸序列
重叠法：小片段重叠的原理主要 用于一级结构的测定
七、确定原多肽链中二硫 键的位置
一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键 的蛋白质 选用该法的好处： • 该酶的专一性比较低，切点多，生成肽 段包括含有二硫键的肽段比较小，对后 面的分离、鉴定比较容易； • 该酶的作用pH在酸性范围，有利于防止 二硫键发生交换而造成的麻烦。
耦联： 使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性 条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽 链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫 甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。 水解： PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基 肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基 的噻唑啉酮苯胺衍生物。
萃取： 将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应 液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基 的肽仍留在溶液中。 转化： 萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸 作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内 酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。
五、鉴定每个肽段氨基酸 顺序
ABCDE
*ABCDE
部分水解
*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE
完全水解
*A,*A+B,……*A+B+C+D+E *A,*A+*B,……*A+*B*+*C+*D+ *E
羧肽酶A法 羧肽酶B法 羧肽酶C法
二硝基氟苯法(Sanger法）
2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链 N-端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍 生物（DNP-氨基酸）
氨基肽酶法
• 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多 肽链的N-端逐个地向里水解。
• 根据不同的反应时间测出酶水解所释 放出的氨基酸种类和数量，按反应时 间和氨基酸残基释放量作动力学曲线， 从而知道蛋白质的N-端残疾顺序
一、氨基酸组成
蛋白质经盐酸水解后成为个别氨 基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分 开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋 白质中的百分组成或个数。
二、末端测定的具体方法
二硝基氟苯法（DNP法） 肼解法 化学法 二甲基氨基萘磺酰氯法 （Dansyl-氯法） 还原成氨基醇法
酶解法
亮氨酸氨肽酶法 细胞外氨肽酶法
羧肽酶 CpA CpB CpC 来源 胰脏 胰脏 植物或微 生物 专一性 能释放除Pro、Arg、Lys外的所有 的C-端氨基酸 主要水解C-端为Arg、Lys的肽键 相当广泛，几乎能释放C-端的所有 氨基酸
还原成氨基醇法
• 多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4） 还原成α-氨基醇，用层析法可以鉴定氨 基酸种类。 • Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采 用此法。
蛋白质一级结构（primary structure）的测定
• 蛋白质测序的发展简史
自从1953 年Sanger首次完成胰岛素的 氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。 但是Sanger花费多年时间才基本搞清胰岛 素的一级结构，现在由于方法改进及自动 化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白 质的氨基酸序列问世。
氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端和羧基末端 为何种氨基酸
把肽链水解成片段
测定各肽段的氨基酸排列顺序 综合运用Байду номын сангаас种水解法分析肽段中的氨基酸顺序
测序前的准备工作
要求： 样品纯度：97%以上 相对分子质量：允许误差在10%左右 （一）多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质 中的亚基。 如果多肽链间通过共价键（S—S）连接在一起，可采用氧化剂或还 原剂将其断裂。 （二）测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即 可确定多肽链的数目。 （三）二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸 胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后 用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。
C-末端之肼解法
• 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链 上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物 能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基 酸分离。 • 肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被 破坏而不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸
羧肽酶法
• 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地 水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基 酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-端残疾顺序
反向遗传法分析多肽链的氨基酸序列
基本原理：中心法则 基本步骤： 1、分离编码蛋白质的基因 2、测定DNA序列 3、排列mRNA出序列 4、按照三联密码原则推演氨基酸序列
为什么进行蛋白质测序?
基因组测序,为了破译遗传密码.现在密码已破,那进行蛋白质组测序有必要
吗? 基因研究贯穿了整个20世纪,100多年里,双螺旋结构的提出,中心法则的发 现,直至基因组的重大突破,使基因研究达到了前所未有的深度与广度. 然而,基因只是信息的携带者,蛋白质才是执行者.基因组计划有其固有的局限性, 基因组测序是否正确,要从其表达的蛋白来验证,否则,只是一堆乱码而已.3.5万 左右基因中一半以上是理论推断,需要从蛋白质角度确认.而且,从蛋白质研究的 自身发展来看,我们无法逃避蛋白质组表达谱分析,只是时间问题而已. 以前,对蛋白质的研究是优于基因的,因为PCR,测序自动化使其发展猛.80 年代末,Hillen Kamp发展的激光解析质谱,Fem J设计的电喷雾质谱可以高效,精 确的测量生物大分子的质量,并测定部分序列,进而用于数据库的检索.Mann M 等再此基础上通过建立"肽质量指纹图谱与肽序列标签"等技术实现了质谱对蛋 白质进行大规模准确快速自动化的测序. 结构生物学是生命科学领域又一个新的研究热点，飞速发展的蛋白质结构 分析技术是研究蛋白质功能的基础。随着蛋白质组时代的来临，许多基因组分 析留下的悬而未决的问题，可能通过直接的蛋白质的分离和鉴定而得到解决。
三、水解肽链成肽段
水解酶或化 水解部位 学试剂 胰蛋白酶 羧基侧 作用的氨基酸 赖氨酸、精氨酸 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色 氨酸和酪氨酸） 甲硫氨酸
胰凝乳蛋白 羧基侧 酶 溴化氰 羧基侧
•水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离 纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。
四、 Edman降解法测定肽 段的氨基酸序列
DNFB
肽段经过分离纯化后， 即可进行氨基酸测序。但是 获得数据之后，还不能得出 整条多肽链的氨基酸排列顺 序，因为尚不清楚这些片段 在多肽链中的先后次序。一 般需要用到多种水解法，并 分析出各肽段的氨基酸顺序， 然后经过组合排列对比，最 终得出完整肽链中的氨基酸 序列。
六、确定肽段在多肽链中 的次序
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错 重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 • — — — — — — — — — — — 多肽
• 氨基酸序列
重叠法：小片段重叠的原理主要 用于一级结构的测定
七、确定原多肽链中二硫 键的位置
一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键 的蛋白质 选用该法的好处： • 该酶的专一性比较低，切点多，生成肽 段包括含有二硫键的肽段比较小，对后 面的分离、鉴定比较容易； • 该酶的作用pH在酸性范围，有利于防止 二硫键发生交换而造成的麻烦。
耦联： 使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性 条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽 链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫 甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。 水解： PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基 肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基 的噻唑啉酮苯胺衍生物。
萃取： 将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应 液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基 的肽仍留在溶液中。 转化： 萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸 作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内 酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。