植酸酶

植酸酶的研究

一：植酸酶的概念

植酸酶又称肌醇六磷酸水解酶，是一种能降解植酸及其盐类的酯酶，属于蛋白质，是磷酸单脂水解酶。其具有特殊空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其他营养物质。

二：植酸酶的发现

植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，而植物、动物中的植酸酶含量低，所以人们对植酸酶的研究重点转向了酶含量较高的微生物。

目前市场所售植酸酶制剂绝大多数属于微生物植酸酶。自然界中许多微生物（丝状真菌、酵母和细菌等）都能产生植酸酶，尤其是米曲霉和黑曲霉都能分泌具有高活力的植酸酶。

三：菌种选育

以黑曲霉霉菌为例从中得到植酸酶：

1.) 采样：可以从植株、果实中采样。

2). 产植酸酶菌株的分离筛选

分离培养基（%）：植酸钙0.1，葡萄糖3.0，硝酸铵0.5，硫酸镁0.05，硫酸锰0.005，硫酸亚铁0.005，氯化钾0.05

分离样品稀释后涂平板，一定温度培养2—5天，产植酸梅的菌株水解植酸钙形成透明圈，以透明圈与菌落直径之比为粗筛的依据。粗筛菌株发酵，测定发酵产物植酸酶的活性，保留活性高的菌株进一步研究。

3). 产酶菌株的诱变

采用紫外线照射对分离菌株进行诱变，将诱变后的菌体做适当稀释后涂布于平板上，培养2—3d后，挑取单菌落接种到活化斜面上，用摇瓶进行初筛和复筛。

细胞破碎提取粗酶液，适当稀释后测酶活（植酸酶活性单位定义：37摄氏度，pH5.5的条件下，1分钟从底物释放1mol无机磷所需要的植酸酶量）。

4). 产酶条件优化

（1）原料配比对产酶的影响麸皮和米糠为畜禽常用的饲料，具有来源广泛价廉等特点，同时还富含植酸盐，对植酸酶的产生有一定的诱导作用。用不同比例麸皮和米糠混合物配制发酵培养基，接种后培养96h，测其酶活。

（2）起始pH值对产酶的影响选用不同起始pH值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）发酵培养基，接种后培养96h，测其酶活。

（3）培养温度对产酶的影响在不同温度（25,30,35,40,45摄氏度）下接种培养96h，测其酶活。

(4)培养基含水量对产酶的影响培养基加水量选用10个（40,45,50,55,60,65,70,75,80,85%）梯度，接种后在30摄氏度培养96h，测其酶活。

（5）硫酸铵的流加量对产酶的影响在发酵过程中采用流加硫酸铵的形式补充一定的N 源

四：酶的提取及分离纯化

1）提取方法：

盐溶液提取：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。当盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐的浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。

酸溶液提取：有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。提取时要注意溶液的pH不能太低以免使酶变性失活。

碱溶液提取：在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。

有机溶剂提取：与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶，可以采用能与水混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。

2）影响提取的因素：温度、pH、提取液的体积：增加提取液的用量可以提高酶的提取率。3）酶的分离纯化：

盐析沉淀法：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉底，从而使酶与杂质分离的过程。

还有：等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法。

五：酶的性质

1)植酸酶生长的最适PH：因为植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是一种特殊的酸性磷酸酶，适合pH为4~6。

2)植酸酶生长的最适温度：其对温度的适应性要求较高，一般适宜温度在46~57℃，当超过60℃时，植酸酶的活性有部分损失，温度达70℃时，则酶活性大部分丧失。经制粒镶嵌成型的植酸酶，最高耐温达85℃。

3)植酸酶的稳定性研究：植酸酶是蛋白质，对光较敏感。使用酶制剂，尽量避光保存以保证植酸酶有较好的作用效果。

注意：在进行酶性质测定时注意化学试剂和金属离子的影响。

六：植酸酶的改造

1．合理设计：合理设计是基于已知氨基酸序列，结构与功能关系而发展起来的蛋白质改性策略。通常合理设计必须依赖植酸酶氨基酸比较，三维结构和活性中心分析等方法确定那些氨基酸或结构单元对植酸梅性质改变起关键作用。然后借助定点突变或杂合酶技术改变植酸梅基因，从而改变氨基酸序列，最终获得高产酶。

2．半合理设计---同序列概念：同序列概念是将已知酶的氨基酸序列防在一起比较，借助计算机的帮助，从中选择对每一个氨基酸位点最保守的残基，拼成序列，然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的DNA序列，再选用合适的表达系统对这个人造的目的基因进行表达，最后获得优于母本的新酶。它不需要了解蛋白质的三维结构，所以它属于半合理设计实验。

3．非合理设计---定向进化：定向进化是酶分子改造的新策略，它主要通过体外模拟自然进化机制，利用基因随机突变，重组和定向筛选技术，使进化朝着人们需要的方向进行。定向进化策略包括突变体库构建和定向筛选两个过程。

七：酶的产业化情况：

定向进化运用于酶分子改造已经取得大量突破性进展，大量酶通过定向改造后成功运用于工业生产。工业化生产商用植酸酶现在市面上的商业植酸酶主要是通过液体发酵得到的，少数企业仍在使用固体发酵方法生产植酸酶。发酵的菌株主要有曲霉和毕赤酵母两大类，他们在植酸酶的生产中只是一种表达系统而异，与产品特性并

没有太多的关系。根据表达植酸酶的基因来源，又可以分为大肠杆菌和曲霉菌，这里指被改良基因的来源，其实在实验室已经被修改(例如定点突变)。固体发酵在5年之前还在中国有一定市场，现在已经很少。用家蚕生产植酸酶尽管有报道，但是在商业生产中很难见到。

酶的应用情况：植酸广泛存在于植物种子内，属天然营养品，植酸最显著的特征是与金属离子有极强络合作用和抗氧化性。这种独一无二的特性使之具有广泛用途。

在发达国家，植酸多已用于食品、医药、化工等行业。

（1）植酸在食品领域的应用

近年来，国内植酸的开发利用、特别是作为食品保鲜剂已引起重视。

用途：

1．饮料中添加0.01-0.05%植酸，可除去过多的金属离子。（特别是对人体有害的重金属）对人体有良好的保护作用。

2．将植酸加入含有单孢丝菌属介质中，可促进微生物的合成及抗氧化性，在乳酸菌的培养基里加入植酸，可促进乳菌的生长。

（2）植酸在饲料行业的应用

植酸酶在饲料行业的广泛应用，给这个行业带来了很大的影响。

1、植酸酶改变了饲料企业对酶制剂的认识，推动了中国饲料添加剂行业的发展，成

为行业关注的热点，同时也成为很多企业重点开发追求经济效益的产品，从1994年进入中国，到1999年国内开始生产，再到2005年在国内市场进行生产或销售的企业大大小小达数十家，并且还有许多大型的饲料企业纷纷宣称要进入酶制剂这个生物技术领域，中国的植酸酶市场不由分说成了一个过度竞争的市场。这种情况下，“价格竞争”几乎成为这些企业进入市场最重要的手段。

2、提高植物性饲料原料中磷的利用效率。这是饲料厂和养殖场使用植酸酶的的重

要原因。通过十年左右的推广，植酸酶已经广泛地用于蛋鸡、肉鸡、猪和鸭饲料中。八：植酸酶的相关注意事项

1、植酸酶作用效果与动物日粮中植酸磷的含量关系密切。植酸磷含量在0.2%以上时，使用

植酸酶有效，植酸(盐)含量越高，植酸酶效果越明显。

2、植酸酶是蛋白质，对光、热较敏感。而在饲料生产过程中，由于粉碎、预混、制粒以及

其它添加剂的影响都可能使酶的活性受损甚至变性。使用酶制剂，应尽可能减少生产工艺对酶的活性的影响，制粒温度最好不要超过80度，以保证植酸酶有较好的作用效果。

3、大量研究证明，日粮中钙元素含量过高会造成植酸酶活性下降，影响植酸酶使用效果，

因此，切忌超量使用石粉作为填充物造成钙超标。

4、防潮：植酸酶一旦受潮易发生霉变且活力下降。

5、防止高温：严禁烈日爆晒、烘烤等，否则均可导致酶活力降低或失活。

6、避免接触强酸、强碱、重金属。

7、尽可能缩短贮存期，使用有效期内的产品。产品应置于通风、干燥、阴凉、避光处。

8、影响植酸酶品质的重要因素之一的pH值，应是人们在购买使用时所要首先考虑的。储存时间是植酸酶品质的又一影响因素。建议现买现用，最迟不宜超过出厂一个月使用。温度对植酸酶活性有很大的影响，是影响植酸酶品质的又一因素。如果有条件尽可能把植酸酶产品置于低温条件下储藏。