医学遗传学实验复习提纲

2.SDS在提取DNA的实验中有什么作用？

SDS是离子型去污剂，能够有效插入脂质双层，破坏膜结构，暴露核物质，而且SDS带有极强的负电荷，具有极强的蛋白质变性作用，可以使胞内的核酸酶变性失活，减少对DNA的降解，保持DNA的完整性。

3.与有机抽提法比较,推测DNA提取试剂盒中各种试剂的作用？

缓冲液GA：可能含有SDS等成分，裂解细胞，为蛋白酶K提供合适的反应体系

蛋白酶K ：消化结合DNA的核蛋白质以及胞内核酸酶，暴露DNA，提高DNA完整性。(这里蛋白酶K的最适温度为56℃)

GA+蛋白酶K应该起到了消化液的作用。

缓冲液GB：可能含有蛋白变性剂，进一步变性蛋白，暴露DNA。(应该属于分离纯化的范畴) 缓冲液GD：主要作用是去除残留的蛋白质。

漂洗液PW：洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质。

洗脱缓冲液TB：用于洗脱结合在亲和柱上的DNA，同时防止DNA降解。

4.反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%?

内切酶需要放在-20℃保存，为了防止溶液冰冻及蛋白质变性，酶液中含有较高浓度的甘油。反应体系中内切酶用量过大会增大反应体系内的甘油含量，较高的甘油浓度会导致内切酶星号活性的产生，使得内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这是我们不希望发生的。

5.配制聚丙烯酰胺凝胶电泳时需要哪些组分？各自的作用是什么？

丙烯酰胺聚合单体

甲叉双丙烯酰胺(bis) 交联单体

过硫酸铵(APS) 催化剂，提供自由基催化单体聚合反应

四甲基乙二胺(TEMED/TMEDA) 引发剂，引发过硫酸铵分解产生自由基催化聚合反应

尿素(变性胶中) 变性剂

Tris碱pH调节剂

6.列表比较聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的异同。

同：

①均为凝胶电泳，原理相同。

琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。

②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。凝胶浓度的选择依DNA 分子的大小而定。

③电泳缓冲液TBE TAE TPE

④指示剂溴酚兰和二甲苯青

⑤染色溴化乙锭银染

异：

①凝胶介质及制备

琼脂糖凝胶电泳中支持物琼脂糖是天然高聚物，加热熔化后冷却形成凝胶，制备简便，快速。聚丙烯酰胺凝胶是由单体室温聚合而成，使用有毒的化学试剂，制备时间长。可长期保存。

②电泳方式

琼脂糖凝胶电泳为水平电泳，电压为1-5V/cm。

聚丙烯酰胺凝胶电泳为垂直电泳，电压为1-8V/cm。

③分子量范围及分辨率

琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.kb-50kb之间。

聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp，分辨率0.2%，相差1bp的DNA也可分开，适

合分离鉴定低分子量蛋白质和核酸。

⏹最主要的问题–污染

⏹指数扩增模板

⏹非常特异

⏹痕量污染物即可导致问题发生

⏹解决方案

⏹使用超纯试剂

⏹在PCR之前、之后纯化

⏹设置阴性对照

⏹分装液体试剂

⏹如有问题则丢弃

⏹使用带有滤芯的吸头

⏹小心移液

⏹如果已经发生…

⏹试着借用其他人的试剂

⏹更换试剂

⏹化学试剂

⏹水

⏹清洁设备

⏹移液器及吸头

⏹实验台

⏹实验时更加小心

⏹移取液体

⏹使用灭菌的清洁吸头

⏹无带或条带弱

⏹缺少组分

⏹检查实验手册

⏹重复

⏹错误的浓度

⏹模板

⏹引物

⏹Taq

⏹MgCl2

⏹错误的引物

⏹检查序列

⏹使用备用引物

⏹设置阳性对照

⏹模板不好

⏹在琼脂糖凝胶上检查模板

⏹片段化

⏹PCR抑制剂

⏹加入已知可进行的PCR

⏹太多

⏹错误的条件

⏹减低严格度

⏹降低退火温度

⏹增加MgCl2浓度

⏹染色错误

⏹检测设备和染液

⏹使用分子量标记

⏹引物二聚体

⏹引物之间互相退火

⏹大约50-100 bp的小片段产物⏹通常由于模板、引物原因造成

⏹引物倾向于退火形成双链

⏹解决方案

⏹阳性对照

⏹重新设计引物

⏹热启动

⏹非特异扩增

⏹检测

⏹凝胶电泳

⏹片段大小不对

⏹使用分子量标准

⏹已知产物大小

⏹解决方案

⏹增加严格度

⏹提高退火温度

⏹降低MgCl2浓度

⏹更改程序

⏹延伸时间

⏹更换引物

⏹减少循环数