蛋白质核酸沉淀分离技术
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同时又中和了电荷，破坏了亲水 胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
2、中性盐的选择
选用盐析用盐的几点考虑：
盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济
Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力 进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。
阴离子： 柠檬酸根-3>酒石酸根-3 >F->I03->H2P04->S04->CH3C00>Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-
V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度
优点
①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他 溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要， 可用透析袋脱有机溶剂）。
缺点
对某些具有生物活性的大分子容易引起变 性失活，操作需在低温下进行。成本高。
2、有机溶剂的选择和浓度的计算
前提：能与水互溶 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过 试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。
盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：
S：离子强度为I时蛋白质的溶解度； S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度； KS：盐析常数。
当溶剂的温度一定时，对 于某一溶质，S0是一常数 β（溶解度常数）
KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。
离子价数
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大 分子蛋白质更易溶解。
图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域
表1 影响蛋白质溶解度的参数
蛋白质性质
分子大小
氨基酸组成 氨基酸序列 可离子化的残基数 极性/非极性残基比率 极性/非极性残基分布 氨基酸残基的化学性质 蛋白质结构 蛋白质电性 化学键性质
溶液性质
溶剂可利用度（如：水）
pH值 离子强度
温度
§3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)可 以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层） 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和
双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳 定性，实现蛋白质的沉淀。
吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有
分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。
§3.4 蛋白质沉淀方法
中性盐盐析法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 金属沉淀法 其他沉淀法
在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格， 可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求 在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
6、注意事项
1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤
或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用
机理分析进展
➢ 加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分 子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。
➢ 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取 代，从而降低了它们的溶解度。
➢ 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间 结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏 水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏 水层，从而使蛋白质沉淀。
一、中性盐沉淀法（盐析法）
盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。
优点 ①成本低，不需要特别昂贵的设备
Salting-in 溶 解 度
②操作简单、安全
③对许多生物活性物质具有稳定作用
Salting-out
缺点 得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。
盐浓度
1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理
最常用的盐：硫酸铵
（1）溶解度大 优 （2）分离效果好 点 （3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。
（4）价格便宜，废液不污染环境。
缺点
缓冲能力弱，具腐蚀性，含N
3、 盐析的操作方法
（1）加入固体盐法 适用：饱和度高，不增大溶液体积
饱和度： 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐
KS分段盐析法
在一定pH、温度条件下，改变离子强度。 适用于早期粗提阶段的分步分离。
Β分段盐析法
在一定离子强度下，改变pH、温度。适 于后期分离纯化和精制。
（2） 蛋 白 质 浓 度
硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：
蛋白质浓度g/L
30 3 30
硫酸铵饱和度%
58 66 65
结果
开始沉淀 开始沉淀 90%沉淀析出
蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2 和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层， 包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子 之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越 厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解 度也越大。
电荷 亲水胶体在水中的稳定因素
总蛋白 目标蛋白
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
总蛋白 目标蛋白
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
方法二
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度
以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋 白质溶解度曲线
浓度。
加入硫酸铵固体的量：查表、计算
查表时 注意温
度
（1）加入固体盐法 20℃ 25℃
g ：加入固体硫酸铵的质量
S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度
（2）加入饱和溶液法
适用：蛋白质溶液体 积不大，所需调整的 硫酸铵浓度不高。
饱和硫酸铵的配制方法
在一定量的水中加入
过量的硫酸铵，加热至50
KS主要取决于盐的性质： 离子半径
KS
介电常数
多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS ； 大而不规则的蛋白分子KS越大。
几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁
几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图
1——纤维蛋白 2——血红蛋白 3——拟球蛋白 4——血清蛋白 5——肌红蛋白
前需用氨水或硫酸调节至所需pH。
二、等电点沉淀法
蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白 质离子具有不同等电点这一特性，依次改 变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去， 最后获得目标产物。
（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，
同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活
上清液
乙醇法沉淀沉 淀物Ⅳ
乙醇法沉淀沉 淀物Ⅴ
废弃沉淀
重新溶解 的沉淀
废弃上清液 白蛋白(纯度96～99％)
图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图
沉淀法分离蛋白质的特点：
生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而 简化生产工艺、降低生产费用；
使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出
或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。
eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白 和96%~99%的白蛋白。
重新溶解的沉淀
血浆 乙醇法沉淀
沉淀物Ⅰ＋Ⅱ＋ Ⅲ
乙醇法沉淀 沉淀物Ⅰ＋Ⅲ
乙醇法沉淀沉 淀物Ⅱ
废弃沉淀
重新溶解 的沉淀
废弃上清液 IgG(纯度99%)
蛋白质量(mg)或酶 活力
蛋白质量(mg)或酶 活力
总蛋白 目标蛋白
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
总蛋白 目标蛋白
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
Байду номын сангаас
5、盐析的影响因素
（1） 离 子 强 度 与 离 子 类 型
来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色
谱分离使用的限制因素降低到最少。
§3.2 蛋白质的溶解特性
蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。
蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部 分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。
4、盐析曲线的制作 方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）
以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓 度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线
蛋白质量(mg)或酶 活力
蛋白质量(mg)或酶 活力
当蛋白浓度增加10倍时，盐析时 所需硫酸铵的饱和度约减小7%。
适宜蛋白质浓度是2.5％～3.0％（25 mg/mL～30mg/mL）
（3）
pH 的 影 响
蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。 改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变 了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等 电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时， pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
注意
在水或稀盐溶液中测得的等电点 与在高盐溶液中测得的等电点结果可 能不一样
（4） 温 度 的 影 响
温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐 和小分子有机物，温度升高溶解度加大。
但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离 子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还 是随温度升高而增加的。
阳离子： Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+> Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+
常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐 蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋 白质的沉淀过程。
（NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ 70.6 75.4 95.3 103 4.9 18.9 43.3 42.2 1.6 7.8 93.8 101
水化膜
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质
（亲水胶体）
脱水
碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
++ + +
+
+
++ +
带正电荷蛋白质
（疏水胶体）
阴离子
阳离子
不稳定蛋白颗粒
带负电荷蛋白质 （疏水胶体）
蛋白质聚集沉淀
由于中性盐的亲水性大于蛋白质 和酶分子的亲水性，所以加入大 量中性盐后，夺走了水分子，破 坏了水化膜，暴露出疏水区域。
未沉淀蛋白质的分率 未沉淀蛋白质的分率
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
123456 78 pH 对大豆蛋白质 pH溶 对大解 豆蛋度 白质的 溶解影 度的影响响
➢利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后， 等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意 调整PH值。
沉淀过程应考虑的问题：
✓ 沉淀能否发生； ✓ 沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用； ✓ 沉淀剂是否容易除去； ✓ 用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。
沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取
▪ 优点：设备简单、成本低、原材料易得、
便于小批量生产； ▪ 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，
➢由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白 质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出， 因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。
主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白
例如：工业上生产胰岛素 粗提液 调PH8.0
去除碱性蛋白质
调PH3.0 胰岛素
去除酸性蛋白质
三、有机溶剂沉淀法
许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、 甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。
V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；
V0：原溶液体积；
－60℃，趁热滤去沉淀，
S2：所需达到的硫酸铵饱和度；
再在0℃或室温平衡1－2
S1：原溶液的硫酸铵饱和度。
天，有固体析出时达100
％饱和度。
（3）透析平衡法
优点 硫酸铵浓度变化连 续，盐析效果较好。
缺点 硫酸铵饱和度的测 定、计算工作手续繁 琐，而且透析袋容积 有限、盐析速度慢、 硫酸铵耗费大。
2、中性盐的选择
选用盐析用盐的几点考虑：
盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济
Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力 进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。
阴离子： 柠檬酸根-3>酒石酸根-3 >F->I03->H2P04->S04->CH3C00>Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-
V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度
优点
①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他 溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要， 可用透析袋脱有机溶剂）。
缺点
对某些具有生物活性的大分子容易引起变 性失活，操作需在低温下进行。成本高。
2、有机溶剂的选择和浓度的计算
前提：能与水互溶 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过 试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。
盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：
S：离子强度为I时蛋白质的溶解度； S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度； KS：盐析常数。
当溶剂的温度一定时，对 于某一溶质，S0是一常数 β（溶解度常数）
KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。
离子价数
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大 分子蛋白质更易溶解。
图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域
表1 影响蛋白质溶解度的参数
蛋白质性质
分子大小
氨基酸组成 氨基酸序列 可离子化的残基数 极性/非极性残基比率 极性/非极性残基分布 氨基酸残基的化学性质 蛋白质结构 蛋白质电性 化学键性质
溶液性质
溶剂可利用度（如：水）
pH值 离子强度
温度
§3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)可 以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层） 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和
双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳 定性，实现蛋白质的沉淀。
吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有
分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。
§3.4 蛋白质沉淀方法
中性盐盐析法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 金属沉淀法 其他沉淀法
在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格， 可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求 在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
6、注意事项
1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤
或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用
机理分析进展
➢ 加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分 子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。
➢ 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取 代，从而降低了它们的溶解度。
➢ 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间 结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏 水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏 水层，从而使蛋白质沉淀。
一、中性盐沉淀法（盐析法）
盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。
优点 ①成本低，不需要特别昂贵的设备
Salting-in 溶 解 度
②操作简单、安全
③对许多生物活性物质具有稳定作用
Salting-out
缺点 得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。
盐浓度
1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理
最常用的盐：硫酸铵
（1）溶解度大 优 （2）分离效果好 点 （3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。
（4）价格便宜，废液不污染环境。
缺点
缓冲能力弱，具腐蚀性，含N
3、 盐析的操作方法
（1）加入固体盐法 适用：饱和度高，不增大溶液体积
饱和度： 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐
KS分段盐析法
在一定pH、温度条件下，改变离子强度。 适用于早期粗提阶段的分步分离。
Β分段盐析法
在一定离子强度下，改变pH、温度。适 于后期分离纯化和精制。
（2） 蛋 白 质 浓 度
硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：
蛋白质浓度g/L
30 3 30
硫酸铵饱和度%
58 66 65
结果
开始沉淀 开始沉淀 90%沉淀析出
蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2 和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层， 包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子 之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越 厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解 度也越大。
电荷 亲水胶体在水中的稳定因素
总蛋白 目标蛋白
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
总蛋白 目标蛋白
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
方法二
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度
以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋 白质溶解度曲线
浓度。
加入硫酸铵固体的量：查表、计算
查表时 注意温
度
（1）加入固体盐法 20℃ 25℃
g ：加入固体硫酸铵的质量
S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度
（2）加入饱和溶液法
适用：蛋白质溶液体 积不大，所需调整的 硫酸铵浓度不高。
饱和硫酸铵的配制方法
在一定量的水中加入
过量的硫酸铵，加热至50
KS主要取决于盐的性质： 离子半径
KS
介电常数
多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS ； 大而不规则的蛋白分子KS越大。
几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁
几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图
1——纤维蛋白 2——血红蛋白 3——拟球蛋白 4——血清蛋白 5——肌红蛋白
前需用氨水或硫酸调节至所需pH。
二、等电点沉淀法
蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白 质离子具有不同等电点这一特性，依次改 变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去， 最后获得目标产物。
（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，
同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活
上清液
乙醇法沉淀沉 淀物Ⅳ
乙醇法沉淀沉 淀物Ⅴ
废弃沉淀
重新溶解 的沉淀
废弃上清液 白蛋白(纯度96～99％)
图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图
沉淀法分离蛋白质的特点：
生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而 简化生产工艺、降低生产费用；
使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出
或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。
eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白 和96%~99%的白蛋白。
重新溶解的沉淀
血浆 乙醇法沉淀
沉淀物Ⅰ＋Ⅱ＋ Ⅲ
乙醇法沉淀 沉淀物Ⅰ＋Ⅲ
乙醇法沉淀沉 淀物Ⅱ
废弃沉淀
重新溶解 的沉淀
废弃上清液 IgG(纯度99%)
蛋白质量(mg)或酶 活力
蛋白质量(mg)或酶 活力
总蛋白 目标蛋白
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
总蛋白 目标蛋白
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
Байду номын сангаас
5、盐析的影响因素
（1） 离 子 强 度 与 离 子 类 型
来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色
谱分离使用的限制因素降低到最少。
§3.2 蛋白质的溶解特性
蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。
蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部 分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。
4、盐析曲线的制作 方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）
以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓 度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线
蛋白质量(mg)或酶 活力
蛋白质量(mg)或酶 活力
当蛋白浓度增加10倍时，盐析时 所需硫酸铵的饱和度约减小7%。
适宜蛋白质浓度是2.5％～3.0％（25 mg/mL～30mg/mL）
（3）
pH 的 影 响
蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。 改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变 了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等 电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时， pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
注意
在水或稀盐溶液中测得的等电点 与在高盐溶液中测得的等电点结果可 能不一样
（4） 温 度 的 影 响
温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐 和小分子有机物，温度升高溶解度加大。
但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离 子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还 是随温度升高而增加的。
阳离子： Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+> Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+
常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐 蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋 白质的沉淀过程。
（NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ 70.6 75.4 95.3 103 4.9 18.9 43.3 42.2 1.6 7.8 93.8 101
水化膜
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质
（亲水胶体）
脱水
碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
++ + +
+
+
++ +
带正电荷蛋白质
（疏水胶体）
阴离子
阳离子
不稳定蛋白颗粒
带负电荷蛋白质 （疏水胶体）
蛋白质聚集沉淀
由于中性盐的亲水性大于蛋白质 和酶分子的亲水性，所以加入大 量中性盐后，夺走了水分子，破 坏了水化膜，暴露出疏水区域。
未沉淀蛋白质的分率 未沉淀蛋白质的分率
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
123456 78 pH 对大豆蛋白质 pH溶 对大解 豆蛋度 白质的 溶解影 度的影响响
➢利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后， 等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意 调整PH值。
沉淀过程应考虑的问题：
✓ 沉淀能否发生； ✓ 沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用； ✓ 沉淀剂是否容易除去； ✓ 用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。
沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取
▪ 优点：设备简单、成本低、原材料易得、
便于小批量生产； ▪ 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，
➢由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白 质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出， 因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。
主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白
例如：工业上生产胰岛素 粗提液 调PH8.0
去除碱性蛋白质
调PH3.0 胰岛素
去除酸性蛋白质
三、有机溶剂沉淀法
许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、 甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。
V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；
V0：原溶液体积；
－60℃，趁热滤去沉淀，
S2：所需达到的硫酸铵饱和度；
再在0℃或室温平衡1－2
S1：原溶液的硫酸铵饱和度。
天，有固体析出时达100
％饱和度。
（3）透析平衡法
优点 硫酸铵浓度变化连 续，盐析效果较好。
缺点 硫酸铵饱和度的测 定、计算工作手续繁 琐，而且透析袋容积 有限、盐析速度慢、 硫酸铵耗费大。