冰浴时间对氯化钙转化法转化效率的影响

安截农业科学．ＪｏｕｒｎａｌｄＡｎｉｍａｌＡ一骊２００７，３５（３０）：９５＂／Ｉ责任编辑孙红忠责任校对幸辨冰浴时间对氯化钙转化法转化效率的影响

张卫林，赵晶，李芬’（河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５娜）

摘要确定大脑杆酋Ｄ｝１５。氯化钙转化击时感受态细胞与质粒混夸物的最佳木浴时间。方法：在保证其他鲁件一致的情况下．谩王太肠杆茼感爱态细胞和质粒混合物的冰洛时问梯度并建立限性对照进行研究。结果：冰洛２０ｍ／ｎ时转化效率最高。结论：与其他冰浴时间相比．冰落２０吡岫时的转化效率最高，实验重复性好，成本低廉．而且操作简便，值得推广使用。

关键词冰浴；感受态细胞；转化效率

中围分类号０６４文献标识码Ａ文章编号０５１７—６６１１（ａ∞７）３０一唧１—０１

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在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时，氯化钙转化法困其简单高效性而尤为分子生物学工作者所广泛采用。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统。它具有生长快速、生长周期短、培养条件简单、安全性好、价格低廉、可以高效表达外源蛋白、适合不同的基因产物、易于进行工厂化批量生产等优点，是人们克隆与表达外源基因的首选菌株。通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。然而，采用氯化钙转化法时，感受态细胞与质粒混合物的最佳冰浴时间目前尚无定论，笔者拟对该问题作一初步探讨。１材料与方法１１材料大肠杆菌ＤＨ５ａ（实验室保存），质粒ｉⅡ＆（购自Ｉｎｖｌｔｒｏ带ｎ公司）。１２试剂氨苄青霉素，氯化钙，琼脂糖，酵母提取物，蛋白胨，氯化钠．琼脂粉，溴化乙锭，Ｔｒｉｓ·碱，乙酸，氢氧化钠，ＥＤＴＡ均购自上海生工。１．３实验方法①按常规方法制备大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ感受

态ｎｏ；②大肠杆菌Ｄ｝１５ｎ感受态（卯ｍ）和质粒ｐＹＥＳ２（２ｒａ）混合均匀；③设置冰浴时间梯度（０、１０、加、３０、４０ｒａｉｎ）和阴性对照（即以２ｍ无菌水代替质粒ｐＹＥＳ２）；④冰浴后４２℃热激９０ｓ，迅速冰浴ＩＳ）Ｂ；⑤加入新鲜ＬＢ培养基８００出，在２００ｒ／ｒａｉｎ、３７℃摇床中预培养Ｉｈ；⑥在１２０００ｒ／ｒａｉｎ条件下离心１ｒａｉｎ，弃上清；⑦加入新鲜ＬＢ培养基１５０ｍ，混合均匀涂布于含抗生素的固体ＬＢ平板上．１２—１６ｈ观察菌落形态和数目；⑧用数码相机对平板进行拍照和观察；⑨随机挑取单克隆于舍氨

苄青霉素的ｕ培养基中，过夜培养；⑩采用常规的碱裂解法提取质粒；⑩琼脂糖凝胶电泳检测阳性率。反复重复上述操作，以检测结果的重复性。

２结果与分析

由图１可知：冰浴加和２０ｒａｉｎ时最好，３０ｒｅｉｎ时次之．１０和０ｒａｉｎ时最差，而阴性对照没有阳性克隆出现也表明该实验方案是可靠的；冰浴４０和２０ｍｉｎ比较，冰浴２０ｎｚｎ时不但转化效率最高，而且没有杂菌背景．更容易筛选阳性克隆。

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注：罔中Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ分别代表球浴时间４０、３０、２０，１０、０ｎｉｎ和阴性对照。

围Ｉ不同津浴时间下氯化钙转化法的转化结果

３讨论否可信的重要指标，经反复实验都得到类似的结果；在实验

与目前常规方法冰浴３一ｌＪ和１０ｍｉｎｅ：ｚ］不同，该实验结果每个环节都力图使各个梯度条件相同，仅冰浴时间有差别，充分表明冰浴２０ｍｉｎ时转化效率最高：对转化平板上的单菌排除了其他因素对实验结果的干扰。因此，大肠杆菌氯化钙落随机抽样，碱裂解法提取质粒电泳检测表明冰浴２０ｍｉｎ时法转化时冰浴２０而ｎ值得推广使用。

阳性率最高，阳性克隆也最多；实验重复性是实验结果是参考文献

基金项目河南师范太学青年科学基金（２００４００ｔ２）；国末自瑞科学基金（３嘣ｘ）３４３）。作者简介张卫林【１％ｌ一），男，河南用口人，项士研究生，研究方向：分子细胞生物学。＊通讯作者，博士，副教授。

收稿日期２０３７－０６旬６［１］Ｊ萨姆布兽克．ＤＷ拉塞尔分子克隆实嘘指南［ＭＩｌｌ黄培堂．王嘉玺，

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　万方数据

冰浴时间对氯化钙转化法转化效率的影响

作者：张卫林， 赵晶， 李芬

作者单位：河南师范大学生命科学学院,河南新乡,453007

刊名：

安徽农业科学

英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES

年，卷(期)：2007,35(30)

被引用次数：2次

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