无菌检验及方法验证

方法验证实验（续）
• 通过阳性微生物在不同条件下的生长对比实验,证明: -在检验前样品的预处理能有效的抵消/中和产品的抑菌 性
-样品的预处理方式和检验过程及培养条件等均不会影 响样品中固有微生物的生长
• 如果知道产品对某种菌存在抑制,则将该菌作为阳性菌, 寻找克服抑制的实验条件,再用其他阳性菌进行检查
USP真菌 20-25度,细菌30-35度 • 记录培养箱的温度,每年校验培养箱的温度 • 定期清洁培养箱 • 培养记录，培养期间每天检查样品,并记录 • 培养基产生悬浮、絮凝、沉淀，14天后将2-5
％培养物转入新鲜的培养基内，再培养7天
阴性对照
• 阴性对照：在进行无菌检测时,没有样品的漏斗作为阴 性对照
无菌更衣
• 无菌更衣，头套，鞋套，护目镜，口罩 • 每次进入更换新的无菌服 • 保留无菌衣灭菌记录 • 实验员需得到无菌更衣的培训和资格确认，并保留记
录
洁净室设备和表面
• 电源插座，日光灯应嵌入墙或天花板内并密封 好，避免非洁净空气进入。洁净室表面应光滑 并耐腐蚀
• 转角光滑，容易清洁 • 应有通讯设备并便于消毒 • 应设有椅子和放置物品的桌面或推车，并便于
果；灭菌记录；人员资格；检验方法； 粒子计数结果；无菌室清洁记录；层流 台过滤器完整性等
• 产品放行前完成调查 • 保存归档
谢谢大家！
限度和行动限度 • 选择合适的培养基,接触碟培养基需要含有中和剂
方法验证实验
• 微生物实验方法验证的目的 • 验证实验:抑真菌/抑细菌实验 • 在对一个产品进行无菌测试之前， 要确认
产品固有的活性不会影响测试的可靠性， 并证明所用的测试程序适合于该产品的无 菌测试。 • 进行无菌测试验证时，所用测试方法应与 正常测试相同。 • 若样品的组分或原检验条件发生改变时， 测试方法需重新验证。
消毒
• 不应存放与实验无关的物品 • 紫外灯
无菌实验室的清洁
• 实验过程中操作表面和操作人员要经常用消毒剂消毒 双手
• 要有无菌实验室的清洁程序SOP • 隔离器有其独特的消毒方法 • 在清洁前确保所使用的清洁剂,消毒剂经过验证,最少
接触时间和灭菌效力.所选择的消毒剂应达到使用要求 • 至少两种消毒剂轮换使用 • 保留清洁剂消毒剂的配制记录,有相应的SOP
• 需记录和计算阴性对照发生的频率
阳性对照
• 阳性对照：在进行无菌试验时将含样品的滤筒 内加入阳性控制菌 – 阳性菌的选择 – 阳性对照要与无菌检查分室进行
• 各国药典/法规对阳性对照的要求：
– EP，USP，TGA
– CP
结果判断
• 培养基澄清或虽然显混浊但经证明并非有菌生长---供 试品符合规定
试验经验 • 样品表面/穿刺部位的消毒 • 物料的进入，过滤器盒的消毒 • 无菌操作注意 • 手和操作表面的消毒 • 蠕动泵的流速 • 空气过滤器的保护
培养基
• 中国药典: 改良马丁和FTM • 美国药典: TSB 和FTM • 购买的RTU培养基/实验室配制的培养基 • 按照相应的SOP编制培养基的批号 • 培养基质量控制（pH，无菌性，灵敏度实验） • 制定有效期 • FTM培养结束后培养基氧化层（粉红色）不应超过培养基深度
• 任何培养基显混浊并确认有菌生长----供试品不符合规 定
• 除非证明生长的微生物非产品固有 • 当满足下列至少一个条件时,判断试验结果无效
– a) 无菌测试实验室微生物监测数据超标 – b) 检查时发现无菌测试过程有误 – c) 阴性对照发现污染 – d) 污染菌鉴定明确表明污染是由于无菌测试所用材料及实验
1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分 钟），迅速冷却，只限加热一次
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 根据药典方法选择阳性菌种(G-,G+,酵母菌,真菌, 环境中分离 得到的菌株) – 购买的RTU培养基每批要进行灵敏度检查 – 将小于100 CFU的阳性菌加入培养基内,计数 – 细菌培养不超过3天,真菌培养不超过5天 – 空白对照无菌生长,加菌的培养基生长良好 – 加入添加剂的培养基须重新进行灵敏度检查 – 菌种制备,保存和培养的SOP – 对新开的菌种冻干管需要对菌种进行鉴定,菌种传代不超过5 代
• 保留培训记录
设施
• 洁净室设计 • 无菌更衣室和气闸 • 洁净室的表面和内部设施
洁净室设计
• 达到无菌生产时相应洁净室级别的要求 • 设备根据相应的要求经过确认（IQ/OQ) • 无菌检查应在环境洁净度10000级背景下的局部100级的单向流
空气区域内或隔离系统内进行 • 无菌检查应在足够大的区域内进行， 物品的放置不会破坏层流 • 每年至少对层流台或隔离器进行一次确认 • 洁净室的空气应通过高效过滤器，如果压差超出范围应该能看到、
无菌检验
• 检验数量:是指一次实验所用供试品最小包装容器的数 量（样品无菌检查）
• 检验量:是指一次实验所用的供试品总量（验证实验， 阳性对照）
• 培养基用量:除另有规定外,应不小于药典规定的量
• 阳性对照:检验实验操作是否按照方法验证的程序进行, 对实验的检验
• 阴性对照:对实验条件,操作人员无菌操作,淋洗液无菌 性的检验
无菌试验及验证
孙冬梅
无菌检查
• 定义 • 背景 • 培训 • 设施 • 无菌试验室的清洁 • 环境检测 • 方法验证 • 无菌检查 • 结果 • 解释和重新测试 • 调查报告
定义
• 营养实验(灵敏度检查):证明培养基能够 growth promotion test 支持微生物生长
• 阴性控制: 用来鉴定假阳性
讨论：菌液的加入
方法验证实验（续）
• 直接接种法
• 取适量的培养基，分别加入试验菌，每 瓶加试验菌10-100cfu，每种菌加2瓶， 其中一瓶加入规定量的供试品，另一瓶 作为阳性对照。按规定温度、时间培养
方法验证实验（续）
• 结果判断 • 如果接种后的培养基和阳性对照相比有明显
的微生物生长迹象，则说明该产品无抑菌活性 或该活性已被削减到满意的程度，无菌测试程 序可以不加修改直接使用。
技术造成
结果的解释
• 如果无菌测试被认为是无效的，用同样数量的 样品进行复试。
• 如果复试没有出现微生物生长迹象，产品通过 无菌测试。如果复试仍出现微生物生长迹象， 产品无菌实验失败。
• 定期对无菌测试结果和阴性对照进行趋势分析
调查报告
• 无菌试验失败需起草调查报告 • 调查包括：细菌鉴定；环境/人员检测结
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 购买药典推荐的菌种 FTM：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，生 孢梭菌 TSB：白色念珠球菌，黑曲霉菌 --至少包含一种环境菌
• 培养基无菌性检查 培养基应在适当的温度下培养14天以检测其无菌性,每批随机抽取 5瓶
-培养基灵敏度检查可以和培养基无菌性检查、无菌检查同步进行
negative controls
• 阳性控制: 用来鉴定假阴性
positive controls
ห้องสมุดไป่ตู้
背景
• 局限性 检出的可能性小，不能检出病毒/支原体，破坏性,
• GMP的要求 在微生物回收率最佳的条件下进行该实验以减少方法的局限性.
• 是无菌产品质量标准中的一项 • 不能证明整批产品的无菌性, 但可以证明产品非无菌 • 实际工作中，没有微生物在培养基中生长,只能判定此批产品在
• 如果无菌实验无效,进行再次实验的样品要能反映最初 样品的特性,取样点或无菌工艺过程的干扰
检验方法
• 薄膜过滤法是首选的方法 • 建议首先润湿滤膜（对小体积的产品和
抗生素必须先润湿滤膜）
• 用方法验证时验证的最少冲洗量的冲洗 液来冲洗滤膜。
• 每张滤膜过滤的体积不要超过1000ml
检验方法（续）
• 对三个批次的产品进行验证 • 细菌培养3天，真菌培养5天 • 与阳性对照比较，含供试品的容器中实验菌生长良好。
否则验证无效。
方法验证实验（续）
• 薄膜过滤法 将规定量的样品按薄膜过滤法过滤，冲洗， 在最后一次冲洗液中加入小100cfu 试验菌。取出滤膜转移至相应的培养基中， 或将培养基加入滤筒内。取另一装有相同体 积的培养基的容器加入等量的试验菌，作为 阳性对照。按规定温度、时间培养。
• 检验规程
Microsoft Word 文档
无菌检验
• COA of Millipore
无菌检验
隔离器内的无菌测试装置
无菌检验
标准无菌测试漏斗 新的无菌测试漏斗
无菌检验
• 封闭式无菌检测系统的安装
无菌检验
• 样品检测
无菌检验
• 加注培养基
• 培养
培养
培养时间
• 培养14天 • 培养温度:CP 真菌23-28度,细菌30-35度
薄膜过滤法可采用的修改方案: • 增加淋洗液、培养基的用量。 • 用其他成分的滤膜而不用纤维素成分的滤膜( 如聚偏二氟乙烯，
尼龙，聚四氟乙烯或聚炭酸酯)。 • 在淋洗液中加入表面活性剂 (如淋洗液K) 来分散产品中的乳化粒
子。为了提高产品的可溶性，可将淋洗液保温到35°C－45°C。 • 如可行的话，在淋洗液中加入一合适的无菌的生物去活物质。
环境监测
环境监测应结合空气和表面取样方法,如 - 空气浮游菌监测; - 沉降碟; - 表面监测:接触碟或擦拭法; - 空气粒子数检测 - 操作员的无菌衣和双手.
• 对环境中分离出的细菌进行鉴定,可以帮助解释无菌实验结果 • 环境监测应在动态条件下进行 • 取样点, 暴露时间,监测频率都应有相应的SOP 规定,并应设置警戒
• 如果加过产品并接种后的培养基和阳性对照相 比生长微弱、缓慢或不生长，则说明该产品的 抑菌活性在该测试条件下没有被减弱到满意的 程度，需要对测试条件进行修改并重新验证至 该产品的抑菌活性被削减到满意的程度
方法验证实验（续）
• 采用一种或更多的方案对无菌测试方法进行修改，重新进行验 证。每个修改方案都必须很好地存档。只需用首次验证时未出现 生长的测试菌株，如果该菌株在修改后的测试条件下可以生长， 则在 同等条件下对所有的测试菌株进行验证。如果修改方法不 能使所有的测试菌株都出现生长，则 采用那个使最多种测试菌 株出现生长的方法。
听到报警 • 不同级区的压差不小于12.5帕斯卡。 • 压差记录/经过验证的计算机检测系统 • 每次实验前检查压差 • 压差表上标明压差的范围
更衣室
• 进入无菌室前更换无菌衣（符合进入生 产区无菌区的更衣要求）
• 在不影响无菌更衣程序的条件下，设计 应方便人员从非洁净室进入洁净室.如长 凳
• 配备穿衣镜，更衣说明，洗手池，洗手 液，干手机，无菌衣存储架
无菌实验
• 取样Sampling • 检测方法Test methodology • 培养基Media • 培养时间Incubation period • 阴性对照Negative test controls • 阳性对照Positive test controls
取样
• 取样要有代表性,如开始,中间,结束
此试验条件下是无菌的；培养基变混浊意味着产品被污染
• 如何保证产品无菌？ 经过验证的恰当的生产工艺或无菌工艺
培训
• 在进行无菌测试前，操作人员必须熟练无菌操
作，经过专门的培训并通过资格认证.
• 确保每次实验操作人员都遵循SOP进行操作并 接受监测。 定期对操作人员进行培训。特别 对经常出现无菌实验假阳性、阴性控制出现阳 性的操作人员