亚低温脑保护作用机制的研究进展(精)

亚低温脑保护作用机制的研究进展
薄立军曹瑞旗董振明
作者单位：050000 石家庄市，河北医科大学第二医院麻醉科
目前国际上将低温分为轻度(33～35)℃、中度(28～32)℃、深度(17～27)℃、超低温(16℃以下)4种。

低温的脑保护作用在古代已经被人们所认知。

20世纪50年代，人们已将深低温(体温降至28℃以下)应用于心血管手术当中以保护脑和其他重要器官。

由于32℃以下低温可能引起低血压和心律失常等并发症。

Ames等研究发现:亚低温(直肠温度33～35℃)状态人体所有器官都可以保持正常状态,且无并发症,因而亚低温脑保护已被广泛地应用于临床。

20世纪90年代以来,临床应用结果表明亚低温治疗重型颅脑创伤,具有良好效果,不产生严重并发症。

目前国内外有些医院已将亚低温治疗列为重型颅脑创伤患者的治疗常规,同时也开展了亚低温治疗脑缺血和脑出血等的实验和临床应用研究。

本文就亚低温脑保护的机制研究现状做以综述。

1.抑制氧代谢率，维持脑血流量,平衡能量供求
亚低温能够降低脑的氧代谢率。

温度与脑的氧代谢率下降接近线性关系，即温度每下降1℃，脑的氧代谢率约降低5%～7%，而低温的脑保护作用结果不能完全用这线性关系来解释。

如降低脑的氧代谢率，其脑保护作用较降低脑氧代谢率增加19～30倍。

Marion等的临床研究表明,32～33℃亚低温治疗能使重型颅脑创伤患者的脑氧代谢率较常规组明显下降,可明显促进GCS5～7分的重型颅脑创伤患者神经功能恢复和改善预后,生存率明显提高。

只达石等报道了对大宗病例的重型颅脑创伤患者进行亚低温治疗研究结果,充分说明了亚低温治疗可以改善重型颅脑创伤患者急性期的脑氧代谢,并且可有效改善预后,提高生存质量。

有报道[4]认为在大鼠脑缺血早期低温较正常温度使局部脑葡萄糖利用率减少了45%，低温也能减轻大鼠脑缺血所导致的脑的异常代谢和pH的改变，从而达到维持能量供求，保护脑的作用。

脑的能量代谢具有特殊性,如对氧的需求量大、仅靠血液转运葡萄糖供能、无糖原及ATP的储备等。

亚低温有降低脑氧代谢，减少能量消耗，
维持脑能量供需平衡的作用。

2．抑制乙酰胆碱、儿茶酚胺以及兴奋性氨基酸等内源性有害因子的释放
近些年来大量实验研究表明,亚低温能有效地抑制脑缺血后内源性毒性产物的产生和释放,从而有效的减轻继发性损伤。

许多神经系统疾病如卒中、脑创伤、AIDS、痴呆等存在兴奋性氨基酸的过度释放及(或)清除减少的情况。

谷氨酸（EAA）是大脑中的一种兴奋性氨基酸。

目前认为,谷氨酸的过度释放是缺血性神经元损伤的主要原因之一。

脑缺血时EAA 可能通过与神经细胞胞体和树突上的N甲基-D-天门冬氨基酸(NMDA)受体或非NMDA受体结合引起两种病理过程:一是引起大量的Na+、Cl-、H2O 进入细胞内,出现神经元性水肿;二是出现迟发性损害,大量Ca2+内流,使细胞内Ca2+超载,激活一系列依赖于Ca2+的酶系统如磷脂酶和蛋白酶,消耗ATP和破坏氧化磷酸化,使能量代谢发生障碍,影响蛋白质合成;产生自由基,攻击细胞膜,破坏细胞骨架蛋白、DNA等,使神经元发生溃变和坏死。

亚低温可明显降低脑缺血细胞外液中EAA和抑性氨基酸(IAA)含量升高,有助于恢复EAA和IAA之间的平衡,减轻由EAA和IAA介导的神经损伤。

20世纪80年代以来,国内外学者已经应用微透析技术对脑组织的病理生理变化做了大量的动物实验和临床研究,近年又有很多学者开始将此技术应用于亚低温治疗的实验研究中,并取得了初步进展。

Winfree 等利用微透析技术测定了动物发生脑梗死前20min、梗死后80min及120min后缺血半暗带(ischemic penumbra,IP)谷氨酸水平,常温组分别为(1.14±0.40)μmol/ml、(10.l±1.45)μmol/ml和(5.722±1.67)μmol/ml；33℃低温组梗死前为(1.73±0.83)μmol/ml,脑缺血后30min即稳定于(3.47±1.37)μmol/ml,证实亚低温能明显地抑制谷氨酸的释放。

亚低温可能通过以下两种途径减少EAA的释放:一是延迟EAA开始释放的时间；二是降低EAA释放的速度,从而减少缺血及再灌流早期EAA含量的增加。

临床上对脑梗死患者在接受亚低温治疗前后脑组织内兴奋性氨基酸的测定也有类似发现,即低温能明显降低缺血早期的谷氨酸、甘氨酸和丙酮酸水平,并且对健侧脑的上述氨基酸水平也有降低趋势。

3．亚低温抑制脑神经元凋亡
神经元凋亡是由各种凋亡刺激信号始动,受细胞内源性基因,酶类和
信号传导途径等调控的瀑布式激活过程。

有研究显示Bcl-2、Bax及Caspase-3基因参与了创伤性脑损伤(TBI)后神经细胞凋亡的调控,Bcl-2是抗凋亡基因,Bax和Caspase-3是促凋亡基因,Bcl-2/Bax表达比例下调可诱发细胞凋亡,Caspase-3表达上调可促使细胞凋亡的形态学特征形成。

Zhang等利用短暂性全脑缺血模型,也发现亚低温(33℃)可以减轻神经元凋亡,促进Bcl-2的表达。

Caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。

张艳等[12]认为亚低温可以抑制caspase-3的活性,促进Bcl-2的表达,抑制Bax的表达和CytC的释放,通过减少脑缺血后神经元的凋亡,从而达到脑保护作用。

Phanithi等应用大鼠MCAO模型发现全身亚低温(33℃)可以使caspase-3表达下降,而且caspase-3水平与凋亡阳性细胞数呈正相关。

Takasu等认为亚低温能显著降低狗脑梗塞模型血浆内皮素-1的浓度,有助于改善脑部微循环,从而保护缺血神经元。

郭曲练等研究发现,再灌注后实施亚低温能有效地降低脑组织丙二醛的含量而超氧化物歧化酶活性增加,减轻脑神经元结构的破坏,从而保护脑缺血再灌注后脑细胞的功能有利于脑复苏。

亚低温通过影响凋亡生化途径中的相关因子,对实验性脑缺血具有神经保护作用。

亚低温抑制神经元的凋亡，可能还与亚低温状态下降低了神经元代谢，抑制核转录因子NF-κβ易位。

4．抑制氧自由基的产生,促进自由基的清除
体内危害性较大的自由基有活性氧自由基和脂类过氧化物。

脑缺血时由于ATP减少,膜泵功能障碍,Ca2+依赖性蛋白水解酶使黄嘌呤脱氢酶(XD)大量转变为黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxide,XO),同时ATP不能用来释放能量,而且还依次降解为ADP、AMP和次黄嘌呤,结果黄嘌呤大量堆积。

再灌注时,大量分子氧随血进入缺血组织,此时大量增加的XO在催化次黄嘌呤转变为黄嘌呤,进而催化黄嘌呤转变为尿酸的两步反应中,都同时以分子氧为电子接收体,从而产生大量的O-2和H2O2,后者再在金属离子参与下形成HO。

因此,脑缺血再灌注时脑组织内O-2等氧自由基大量增加。

氧自由基广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经元膜和血管,引起脂质过氧化瀑布反应,蛋白质则发生变性失活,NA多核苷酸主链断裂,碱基发生修饰,使细胞的完整性和结构破坏,膜的通透性、离子转运、膜屏障功能及生物功能均受影响,从而导致细胞死亡。

脑缺血缺氧时,自由基的清除系统
受到破坏,再灌注开始后自由基急剧大量增加。

自由基使血管内皮细胞肿胀,脑血流进入延迟性低灌注期,出现无再流现象。

然而再灌注后实施亚低温能有效地降低脑组织丙二醛的含量,而超氧化物歧化酶活性增加,减轻脑神经元结构的破坏,从而保护脑缺血再灌注后脑细胞的功能,有利于脑复苏。

减少脑缺血后纹状体内羟自由基的产生,使其与水杨酸反应生成的2,3二羟安息香酸(2,3 DHBA)明显减少。

Maier等研究发现,亚低温可以抑制脑缺血半暗带和对侧相应区域超氧阴离子O-2的产生,但对超氧化物歧化酶(SOD)的表达无影响。

由此可见,亚低温可以抑制氧自由基的产生,而并不增加氧自由基的清除。

5．抑制一氧化氮合酶的合成和一氧化氮合酶的生成
一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)催化左旋精氨酸与氧分子生成一氧化氮。

NOS有3个亚型:神经元型NOS(neuronal NO synthase, nNOS)、诱导型NOS(inducible NO synthase, NOS)和内皮细胞型NOS(endothelial NO synthase,eNOS)。

nNOS和eNOS又统称为结构型NOS(constitutive NO synthase, cNOS),两者在中枢神经系统中依赖细胞内钙离子的增加而生成少量的NO,可调节突触的可塑性和神经信号的传导,维持脑血流、抗血小板集聚以及白细胞粘附,对神经细胞具有保护作用；而iNOS在生理情况下并不表达,但在病理情况下iNOS的激活能产生大量的NO。

由iNOS产生的NO在介导兴奋性毒性作用、自由基形成及神经细胞凋亡中具有重要作用,它参与了继发性脑损伤。

在一些脑缺血和脑外伤的实验研究发现,iNOS源性NO是继发性脑损伤潜在介导因素。

目前脑外伤后iNOS大量表达的机制不太清楚,认为可能与以下有关:①脑外伤后由于炎性源性因子的产生,导致伤灶星形细胞和巨噬细胞内iNOS大量表达。

②外伤后由于蛛网膜下腔出血,红细胞溶解后,来自高铁血红蛋白的血红素刺激血管平滑肌细胞表达iNOS。

调节脑外伤后NOS的活性,早期维持cNOS产生生理量NO,晚期抑制iNOS表达过量的NO,是局灶亚低温脑保护作用的可能机制之一。

有学者采用微荧光测定法测定神经细胞内钙离子浓度,并观察不同温度对缺氧后脑片神经元内钙离子浓度的影响,结果发现亚低温能显著抑制缺氧所造成的神经元钙离子内流,降低神经细胞内钙离子浓度。

脑缺血早期大量兴奋性氨基酸谷氨酸产生,与神经元胞膜上NMDA受体结合,
使胞内Ca2+增加,激活Ca2+依赖性nNOS活性。

亚低温能显著减少脑损伤后脑组织一氧化氮的含量,从而发挥对脑神经元的保护作用。

缺血再灌注后NO生成增多,而亚低温可减轻NO的急剧升高的神经毒性作用，同时抑制再灌注后NO生成。

6.抑制即刻早期基因的表达
即刻早期基因(immediate-early genes,IEGs)是一类可被第二信使诱导的原癌基因,具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变偶联起来的效应。

IEGs包括c-fos、c-jun、c-myc和eyr家族等。

参与激活神经元死亡基因之一的c-fos对缺血缺氧引起的营养支持的匮乏这样一个外部信号起反应,即表达增加。

这将引起连锁的分子事件,包括杀手蛋白的合成及诱导对细胞存活至关重要的细胞内看家蛋白的丢失,这两种蛋白均可导致神经元变性及死亡。

同时,c-fos能抑制使细胞维持生存的一些基因的表达,维持着随后的细胞死亡过程并维持很长时间。

c-fos是直接原癌基因，他编译出的蛋白c-Fos和Jun蛋白系列c-Fos作为AP-1的成分，它通过抗增值而参与了细胞的调亡。

有研究表明脑缺血后脑组织FOS表达明显的增加。

再灌流以后,随着再灌流的进行,FOS表达不断的增加,到再灌流4d，FOS表达仍高于缺血前的水平。

Kamme等认为低温能增强某些即早基因如c-fos、c-jun等的表达，而即早期基因能调节蛋白质合成，发挥脑保护作用。

亚低温能防止再灌注损伤对蛋白合成环节的抑制，也可能是促使bcl-2表达升高的原因之一。

7．抑制炎症级联反应
有研究表明,脑缺血后脑组织局部过度的炎症反应是造成脑缺血性损伤的主要原因之一,炎症细胞因子的参与是急性脑损伤后的继发性炎症反应的关键环节。

IL-1βmRNA的表达均明显增加,并在神经组织损伤的病理过程中起重要作用,TNF-α和IL-1β等炎症递质可激活局部血管内皮细胞和白细胞,诱导细胞表面粘附分子数量及功能明显上调,造成白细胞与内皮细胞大量牢固的粘附,导致微血管阻塞,从而加重脑组织的损伤。

正常情况下,中性粒细胞和内皮细胞表面黏附分子表达的量较少,但脑缺血后的再灌流导致炎症细胞因子的表达,尤其是TNF-α和IL-1β,刺激补体的联级降解而累及局部的内皮细胞、神经元、星形胶质细胞和血管周细胞,引起细胞黏附分子表达的上调和免疫反应中各组分表达的改变。

动物实验
和临床观察揭示，压低温能显著抑制炎症细胞在缺血区血管内聚集和粘附，以及随后在缺血区脑实质内浸润，尤其是在缺血周边区的浸润，从而阻断炎症级联反应期到脑保护作用。

Deng等用大鼠制成大脑中动脉栓塞模型，同对照组相比，缺血1d后，缺血期亚低温组ICMA-1降低51%,缺血3d后，ICMA-1减少91%，认为亚低温能抑制ICMA-1过度表达，抑制炎性因子的产生。

因此Deng认为亚低温能明显抑制脑缺血再灌注后的白细胞聚集和炎性细胞因子的产生,是亚低温发挥脑保护作用的一种重要机制。

8. 调节损伤后钙调蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶的活性
脑缺血/再灌时，由于谷氨酸的释放，并与NMDA受体结合，使胞浆内Ca2+增多和PLC激活，胞浆内钙增多可以激活PLA2和PLD，PLA2可以水解磷脂生成不饱和脂肪酸（如亚麻酸，油酸，花生四烯酸，二十碳六烯酸），这些不饱和脂肪酸可以在钙浓度很低的条件下激活PKC。

此外PLA２水解磷脂生成血性脂酰胆碱也可以参与PKC的激活．PLD可以水解脂酰胆碱生成磷脂酸，磷脂酸在磷脂酸水解酶的作用下生成DG。

此外PLD水解磷脂酰胆碱还可以生成磷脂酰肌醇也参与了PKC的激活。

在缺血条件下，激活的PKC又可以激活PLA２和PLD，形成恶性循环，从而导致的PKC持续激活。

缺血导致血氧降低和葡萄糖传递减少，使细胞内ATP生成减少，进而激活ROS，ROS可以激活PKC。

缺血时细胞内钙离子增多，导致线粒体功能失常，导致细胞死亡和调亡。

同时，细胞内钙离子增多也可以激活PLC,PLC近而激活PKC，PKC的激活可以导致血管的收缩，加重脑组织缺血。

脑缺血/再灌时，释放的谷氨酸与NMDA受体结合，细胞内钙离子增多，激活δPKC，PKC作用于线粒体，导致线粒体释放细胞色素C，Cytc使Caspases激活，导致DNA断裂，细胞死亡和调亡。

PKC的移位激活可以降解细胞骨架成分。

Tohyama等(1998)采用佛波脂(phorbrol 12,13-dibutyrate,PDBu)放射自显影方法研究大鼠局灶脑缺血2小时后低温干预对PKC激活作用的影响,发现常温组大鼠PDBu的结合力升高,而低温组大鼠PDBu的结合力在程度和范围两方面均受抑制,说明低温可减轻PKC的激活,在一定程度上揭示了低温的脑保护作用。

综上所述，在亚低温状态下,人体生理和许多病理过程将发生极其复杂的变化。

脑缺血/再灌注过程中,兴奋性氨基酸释放、氧自由基产生、
NOS和即刻早期基因c-fos激活、神经元的坏死和凋亡是一个连锁反应过程。

亚低温脑保护是由于抑制了这个连锁反应过程中某一个关键环节,还是对其多个环节均有影响,目前尚不清楚,有待进一步研究。