Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究

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收稿日期：２００４－０６－０２ ＊通讯作者 基金项目：吉林省科学技术厅资助项目（２００２０２１１） 作者简介：刘艳秋（ １ ９ ７ ４ － ），女，助教，硕士研究生，研究方向为生物工程。
化系统的不良反应，麻疹，贫血，白细胞和血小板减 少症，头晕和乏力等副作用的问题，是一种高效、无 毒、无副作用的降糖食品。并且用富含油酸、亚油酸 等不饱和脂肪的植物油（ 豆油、玉米油、山茶油） 取代动 物脂肪，有益于糖尿病患者减少胆固醇的吸收。本实 验还探讨了有机铬和乳酸锌乳化的最佳工艺条件，保证 了铬、锌在奶粉中的均匀分布，产品具有速溶性（ 冲调 性好） 、香味纯正（ 口感好） 、稳定性好（ 保质期长） 、流 动性好（ 易于实现自动化包装） 等特点，为大规模工业化 生产提供技术依据。
蛋白质含量测定 凯氏定氮法；蛋白酶活力测 定 Ｆｏｌｉｎ－酚法；蛋白质水解度（ＤＨ）测定与控制 ｐＨ－ ｓｔａｔ 法。 １．４ 试验方法
１．４．１ 大豆蛋白预处理 据资料［６］介绍，浓度为５％～８％ 大豆蛋白溶液在８５～
９０℃温度下加热处理 １０ｍｉｎ 左右，可使大豆蛋白致密的 立体结构变得松散，有利于提高大豆蛋白的酶解速率， 但随着底物浓度的增加和加热时间的延长，蛋白分子会 通过疏水作用和二硫键作用形成网状聚合体，反而会降 低蛋白酶解速率。结合本试验设计方案，各浓度大豆蛋 白溶液在 ８０ ℃温度下恒温水浴 １５ｍｉｎ，效果较好。
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※工艺技术
Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ：ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎｉｎ；ｇＳＰＩ；ｐｒｏｔａｍｅｘ ｐｒｏｔｅａｓ；ｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ 中图分类号：ＴＳ２２４ 文 献标识码：Ａ 文 章编号：１００２－６６３０（２００５）０６－０１５５－０４
司；Ｐｒｏｔａｍｅｘ复合蛋白酶（食用级） 丹麦诺维信（ＮＯＶＯ） 公司，酶活力 ２５０００Ｕ；其它试剂 均为 ＡＲ 级。 １．２ 仪器
电子分析天平Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＳ２１０Ｓ型 德国赛多利斯 股份公司；恒温水浴锅ＤＳＹ－１－２孔型 北京国华医疗器 械厂；ｐＨ－ｓｔａｔ装置（ＫＦ－５Ｌ发酵罐使用部分功能） 韩国 ＫｏＢｉｏ Ｔｅｃｈ Ｃｏ． Ｌｔ；ｄ 低温冷冻离心机Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｒｉ－ ｆｕｇｅｓ ３Ｋ１８型 美国Ｓｉｇｍａ公司。 １．３ 检测方法
应用五因素五水平的二次回归旋转组合设计，可使 试验组合由 ３１２５次压缩到 ３６ 次，通过试验获得的参数， 借助分析软件对数据进行科学处理，建立数学模型，完 成试验方案的模拟运算、统计分析，可筛选出最优化 的生产条件，并通过调控生产条件可获得较高水解度的 综合方案。
１ 材料与方法
１．１ 材料 大豆分离蛋白（金龟２２００） 吉林不二蛋白有限公
※工艺技术
食品科学
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１．４．４．１ 各因素水平及变化间距 单因素试验确定了各因素的零水平应取数值，分别
为：ｐ Ｈ ＝ ７ ． ５，Ｔ ＝ ５ ０℃，ｔ ＝ ６ ｈ，［ Ｓ ］ ＝ １ ０ ％，［ Ｅ ／ Ｓ ］ ＝ ２ ． ５ ％。 其中，Ｚ０ｊ＝（Ｚ２ｊ＋Ｚ１ｊ）／２；△ ｊ＝（Ｚ２ｊ－Ｚ０ｊ）／ γ；γ ＝２ 则水解条件因素水平及变化间矩，见表 １ 。
１．４．２ 水解度的检测方法［７～１１］ 大豆蛋白水解度（ＤＨ）以水解断裂的肽键数目（ｈ）占总
肽键数目（ｈｔｏｔ）的百分数来确定，即 ＤＨ＝ｈ／ｈｔｏｔ × １００％。 依据 ｐＨ－ｓｔａｔ法，蛋白水解度可由水解过程中 ＮａＯＨ
的消耗量来计算。计算公式如下： ＤＨ％＝Ｂ × ＮＢ ×（１／ α）×（１／ＭＰ）×（１／Ｈｔｏｔ）× １００ 公 式 （１） 式中： Ｂ —水解过程中所消耗的 Ｎ ａ Ｏ Ｈ 溶液量 ＮＢ —溶液的当量浓度 α—为α － 氨基解离度，１／ α＝１＋１０＾（ ｐＫ － ｐＨ） ｐＫ 为大豆蛋白质α － 氨基的 ｐＫ 值 Ｍ Ｐ —底物蛋白质的总量 Ｈｔｏｔ—每克蛋白质中肽键的克当量数（取８．３８）
１．４．４ 水解条件优化试验设计 在 Ｐｒｏｔａｍｅｘ复合蛋白酶水解大豆分离蛋白时，其最
佳作用条件会随着 ｐＨ 值、水解温度（Ｔ）、水解时间（ｔ）、 底物浓度（［Ｓ］）、酶与底物浓度比（［Ｅ／Ｓ］）等因素的变化会 有所不同。首先通过单因素试验确定五因素的取值水平 范围，然后以水解度（ＤＨ）为指标，选用 ５ 因素（１／２实施） 回归正交旋转组合设计方案进行研究，以确定最佳水解 条件。
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Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｔａｍｅｘ Ｐｒｏｔｅａｓｅ
ＬＩＵ Ｙａｎ－ｑｉｕ，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎｇ＊，ＳＵＮ Ｙａｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８， Ｃｈｉｎａ）
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１．４．３ 大豆蛋白的酶解操作 根据试验设计方案，称取大豆分离蛋白加入适量水
配制成为一定浓度的大豆蛋白溶液，经恒温水浴预处理 后，调节温度至反应温度搅拌 ２ ０ ｍ ｉ ｎ，调节 ｐＨ 值至反 应 ｐ Ｈ 值，加入一定比例蛋白酶，在反应温度下进行恒 温酶解，酶解过程中需要不断进行搅拌，同时通过滴 加 ４Ｎ 的 Ｎ ａ Ｏ Ｈ 溶液以保持反应体系 ｐＨ 值恒定，反应偏 差一般控制在± ０．１。达到反应预定时间后，调节 ｐＨ 至 大豆蛋白等电点（ｐＨ４．３），之后将大豆蛋白酶解液加热升 温至 ８５ ℃，保温 １ ０ ｍ ｉ ｎ 使酶活力丧失，然后通过低温 离心机在 １２０００ｒ／ｍｉｎ，１０℃下离心 １０ｍｉｎ，除去未水解 大豆蛋白和其它非溶性物质，倾倒出上清液置于 ４ ℃冷 藏保存。记录 ＮａＯＨ 溶液的滴加量，利用公式（１）ｐＨ－ｓｔａｔ 法计算水解度。
大豆肽是以大豆蛋白为底物经蛋白酶水解后获得的 蛋白质水解产物，它由不同分子量的多肽混合组成， 水解产物中还含有少量游离氨基酸、糖类、无机盐 等。大豆肽具有特殊的理化特性和生理机能，如良好 热稳定性、水溶性，易消化吸收，低抗原性及促进脂 肪代谢，降低胆固醇，抗氧化等作用。近年来，以 酶法水解大豆蛋白来提高其营养保健价值及加工功能特 性已成为研究热点［１，２］，不同研究者所选用的蛋白酶系不 同或采用不同分离方法，获得了功能特性更为广泛的大 豆肽［ ３～５ ］。
Table 1
水平 Ｚ２ｊ（上水平） Ｚ０ｊ（零水平） Ｚ１ｊ（下水平） △ｊ（间距）
表１ 水解条件因素水平及变化间矩 Five influencing factors of DH and spaces between
levels of each factor
ｐＨ
Ｔ（℃）
ｔ（ｈ）
［Ｓ］（％） ［Ｅ／Ｓ］（％）
但由于酶解过程中的影响因素较多，因素变化范 围较大，如采用一般的回归分析，由于各因素所取水 平不同，对应的各个预测值 Ｙ 的方差不同，影响了不 同预测值之间的直接比较。为了克服这一不足，本文 引入二次回归正交旋转组合设计方法，对中性内切蛋白 酶— Ｐｒｏｔａｍｅｘ复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的条件进行 研究。
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Ｐｒｏｔａｍｅｘ 复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究
刘艳秋，陈 光 ＊，孙 旸 （吉林农业大学生物技术学院，吉林 长春 １３０１１８）
摘 要：为优化大豆分离蛋白酶水解条件，本试验采用二次回归正交旋转组合设计方法对 Ｐｒｏｔａｍｅｘ复合蛋白酶水 解大豆分离蛋白的条件进行研究。建立了水解度（ Ｄ Ｈ ）与 ｐ Ｈ 值、反应温度、反应时间、底物浓度、酶与底物浓 度比之间的数学模型；并获得最佳水解工艺条件：ｐＨ 值 ６ ． ５，温度 ４０℃，水解时间 １０ｈ，底物浓度 １４％，酶与 底物浓度比 ４ ． ５ ％；主成分分析表明，ｐ Ｈ 对 Ｄ Ｈ 的贡献率最大。 关键词：回归旋转设计；大豆分离蛋白；Ｐ ｒ ｏ ｔ ａ ｍ ｅ ｘ 复合蛋白酶；水解
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｈｅｓｉｓ， ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ （ＳＰＩ） ｂｙ Ｐｒｏｔａｍｅｘ ｐｒｏｔｅａｓｅ， ｓｅｃｏｎｄ－ ｏｒｄｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ． Ｔｈｅ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ｍａｔｒｉｘ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ （ＤＨ） ａｎｄ ｆｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ（ｐＨ ｖａｌｕｅ， ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）． Ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｓｃｈｅｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ： ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ １０ｈ， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｔ １４％， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｔ ４．５％， ｐＨ６．５ ａｎ℃ｄ． ４ Ｂ０ｙ ｍａｉｎ ｍｅｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐＨ ｖａｌｕｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ＤＨ ｍｏｓｔｌｙ．