拟南芥基因克隆的策略与途径

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拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经
完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。

同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，
拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许
多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。

不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,
都必须首先将所要研究的基因克隆出来。

特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。

本文就基因克隆的几种
常用方法介绍如下。

1、图位克隆
Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.
图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。

用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。

用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。

它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。

近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。

目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。

在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。

这和反向遗传学（reverse genetics）的方法正好相
反。

图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。

这些数据被储存在专门的数据库中（表1）（Lukowitz等，2000）。

在拟南芥中的图位克隆，在很大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。

实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。

实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。

迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（Wang等，2000）。

其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNPs）。

SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测非常直接，但是我们需要设计引物来检测假定的SSLP标记；对SNPs标记的检测也比较直接，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于非编码区域（Peters等，2003）。

最常见的用于检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。

另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等，1989；Michaels 和Amasino，1998）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。

图位克隆法随着相关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。

表2 用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因
本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所帮助。

2 图位克隆的一般过程
因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直接。

图2例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。

从基于Col-0和L er遗传背景的突变体出发，我们有可能在大约一年时间内找出与这个突变相关的基因，这其中主要耗时间的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。

作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者L er）的植株杂交。

在大多数情况下，用于杂交的突变体植株是作为父本还是母本是没有关系的。

然后播种F1代种子。

在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。

F1代植物的表型的出现或者消失将显示着我们所研究的突变是显性的还是隐性的。

最好通过对一些标记的分析来确认F1代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。

当然也有必要确认原来的生态型背景。

图2 图位克隆过程示意图（Jander等，2002）
F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的粗定位（first-pass mapping，图2）。

在其生长过程中，我们可确定其表型，大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情况下是纯合突变体，在显性突变的情况下是纯合野生型）。

然后从这150个个体的叶子或者其它组织中制备DNA用于基因型分析。

起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距20 cM）进行分析，确定突变基因是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包含突变基因的大约20 cM的遗传间隔。

一旦这样的一个遗传间隔被定义之后，接下来的工作就是引入新的标记把这个间隔缩小到大约4 cM。

一般来说，利用150个F2代个体是在很大程度上能找到这样一个遗传间隔的，距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分析。

下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fine-resolution mapping，图2）。

最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小到40 Kb甚至更小（这在拟南芥中大约是0.16 cM）。

显然用于作图的F2代植物越多，就越能精确地定位突变基因。

一般需要3000~4000个F2代植物个体（包括粗定位时的600个F2代植物个体）来精确地定位突变基因。

但是也有很多图位克隆过程用了少于3000个F2代植物个体就成功地定位了突变基因（Lukowitz等，2000）。

但是这往往要冒因为作图群体不够大再一次种植F2代植物而延长整个作图过程的时间的风险。

在这个大约4 cM的遗传间隔内找到与突变更紧密连锁的分子标记，一般情况下能在突变两侧找到相距小于40 Kb的两个分子标记。

一旦这样的两个分子标记被找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。

一种有效的方法是设计PCR引物来扩增覆盖这40 Kb的多个重叠的500 bp的片段。

将这些片段测序后拼接起来以得到整个40 Kb的序列，然后将它与野生型植物（Col-0或者L er）的序列进行比对，这就可以找到这个区域中的多个基因。

从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。

现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息
库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA 序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。

功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。

利用新兴的RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。

同源克隆：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的文库中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因，当然在没有全同源探针的情况下，可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。

图位克隆
同源克隆
转座子标签
表达序列标签(expressed sequence tags, EST)是从一个随机选择的cDNA克隆进行5′端和3′端单一次测序获得的短的cDNA部分序列, 代表一个完整基因的一部分。

DbEST，database EST 表达序列标签数据库。

1951年Barbara Mclintock首先在玉米中发现了控制元件，后来命名为转座元件或转座子(transposon)。

转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。

这一元件不仅可用于分析生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，还为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具，可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposon tagging)，又称为转座子示踪法。

其原理是利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相
邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因〔1〕。

1984年，用转座子标签法首先在玉米中分离了bronze基因，该基因编码了玉米花色素合成途径的关键酶——UDP-葡萄糖类黄3-O-葡萄糖基转移酶〔2〕。

此后还利用转座子标签技术分离了许多植物基因。

转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子(retrotransposon)。

第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入基因组DNA中。

根据转座的自主性，这类元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件，前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则需在自主元件存在时方可转座，以玉米的Ac/Ds体系为例，Ac(Activator)属于自主元件，Ds(Dissociation)则是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能转座〔1〕。

第二类转座子又称为返座元(retroposon)〔3〕，是近年新发现的由RNA介导转座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。

目前共发现了3种类型反转录转座子：
Tyl-copia类，Ty3-gypsy类和LINE(long interspersed nuclear Clements)类转座子，前两类是具有长末端重复的转座子，LINE类转座子没有长末端重复。

高等植物中的反转录转座子主要属于Tyl-copia类，分布十分广泛，几乎覆盖了所有高等植物种类〔4〕。

克隆转座子主要有两条途径：其一，利用抗体识别或cDNA探针从野生型植株中获得表达量降低或不稳定基因座的序列，再从突变体中分离得到相应的转座子：其二是根据序列同源性，在基因组的不同位置分离同一家族的转座子成员。

目前已经克隆的植物转座子约156种(来自Genbank的报告
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一、互联网的诞生
1.互联网诞生的历程
2.互联网与信息化社会
二、知识经济的发展
1.知识经济出现的时代背景
2.知识经济的内涵及发展概况
3.知识和信息对社会的影响
三、工作和生活方式的革命
四、面临的问题
重点：信息化社会的主要内容及影响
难点：知识经济的内涵
【教学方法】
由于本课的内容更加贴近于学生生活的实际，资料容易搜集，并且也很有趣味性，因此在教学前应该引导学生搜集网络发展的资料，以锻炼学生收集整理资料的能力，不断加深对历史和现实的理解。

在教学时教师在帮助学生理清课本基本线索的同时，充分利用学生课下找到的相关资料和教材中有关资料，进行交流，以充分发挥学生学习的主体性、积极性和参与性，注意把历史知识的传授和思想教育结合在一起。

这既符合新课改的精神，又符合学生的心理发展特征，也有利于培养和提高学生的学习兴趣和历史思维能力。

【导入新课】
20世纪是科学技术日新月异的世纪，是高科技层出不穷的世纪。

电子计算机是20世纪人类最伟大的发明之一。

它把人类社会引入“信息时代”。

信息网络化成为20世纪新生的事物得到迅速的发展和普及，对人类的政治、经济、文化、军事、社会生活都产了深远而重大的影响。

由此导入新课。

【讲述内容】
一、互联网的诞生
1.互联网诞生的历程
提问：现代信息科学技术诞生的理论基础是什么？学生阅读教材后概括指出：电子计算机的问世。

1946年，世界上第一台计算机诞生。

虽然它是一个几层楼高的庞然大物，耗资巨大且功能不够完善，但它奠定了现代信息技术的基础。

随后计算机不断更新换代。

计算机的发展已经走过了电子管、晶体管、中小规模集成电路和大规模集成电路四个时代。

以计算机和通信技术为核心的现代信息科学技术的发展，为互联网的诞生奠定了理论基础。

20世纪60年代末，在美苏争霸的“冷战”时期，美国处于和苏联争夺世界霸权的需要，加紧了对信息科学技术的研究和开发，直接推动了互联网的产生。

1969年美国建成了世界上第一个采用分组交换技术的计算机网络四大实验室，这是计算机互联网（因特网）的前身。

这个网路的基本要求是当战争爆发时，即使网路上的线路或设备部分遭到破坏，系统仍能正常运作。

20世纪90年代以来，由于通信技术和计算机技术的飞速发展，互联网进一步发展为全球信息网。

2.互联网与信息化社会
全球信息网（World Wide Web），音译为万维网，顾名思义就是包罗万象的可存取信息的全球性网络。

它是人们可以进行相互交流的抽象空间，主要由互联的文本页面、图像、动画、音像及三维世界构成。

引导学生回顾必修教材Ⅱ，媒介发展的四个阶段的发展历程。

然后指出：一
般认为，以纸质为媒介的报纸是第一媒体，以电波为媒介的广播是第二媒体，以图像为媒介的电视是第三媒体。

而互联网是通过计算机网络传播信息的文化载体，这种以数字化的方式存储、处理和传播，以比特为计量单位的电子媒介被人们称为“第四媒体”。

提问：互联网的优势是什么？学生阅读教材后概括指出：快捷、方便、高效等。

国际互联网可以提供电子邮件收发、资料检索、浏览新闻、休闲游戏、网上购物、网上远程教育、远程医疗、网上谈心等等。

网络媒体作为一种新的传播媒体，具有界面直观、音色兼备、链接灵活和高速传输的特点。

互联网不仅具备传统媒体的所有用途，而且具有传统媒体不具备的优势，互联网作为继报纸、广播、电视后的第四媒体，已经融入到人们的日常工作和生活中，为人类提供了极其丰富的信息源，是人类进入信息化社会的显著标志。

信息技术飞速发展，人类进入了信息化社会。

信息化社会既是科技革命的成果，也带来了一场经济革命。

在互联网时代，人类的生产、生活、工作和思维方式发生了深刻变化。

二、知识经济的发展
1.知识经济出现的时代背景
20世纪90年代，一种新的经济形态──知识经济在美国首先出现。

提问：知识经济出现的时代背景是什么？学生阅读教材后概括指出：传统工业陷入了困境和现代信息科学技术的发展是知识经济出现的时代背景。

然后教师指出：20世纪60年代以后，自然资源的过度消耗和废弃物的大量排放导致全球生态危机，地球已经不堪重负，查的工业经济陷入了发展的困境。

于是人们开始反省工业文明的种种弊端，迫切需要建立一种能源消耗低，技术含量高的经济。

而现代信息科学技术的发展，为这种经济的出现提供了物质技术条件。

20世纪90年代，知识经济应运而生。

2.知识经济的内涵及发展概况
所谓知识经济就是一种以知识为基础的经济，它是建立在知识和信息的生产、分配和使用之上的新型经济模式。

在美国首先出现，这就是知识经济。

信息经济是以现代信息技术等高科技为物质基础，信息产业起主导作用的，基于信息、知识、智力的一种新型经济。

信息经济是知识经济的主要成分，信息经济有、知识经济、数字经济、网络经济智能经济等各种叫法。

知识经济是是21世纪的经济主流。

知识经济的发展可以最大限度地降低资源消耗，大大提高劳动力和资本的使用效率。

因此，知识是一种无穷无尽的资源，知识经济符合可持续发展战略，有利于经济增长方式的转变。

20世纪90年代以来，信息经济在世界各地得到全面发展，信息经济成为国民经济发展最快的部门。

指导学生阅读教材【历史纵横】的有关内容，了解信息高速公路的相关知识。

然后教师指出：1992年9月，克林顿把“兴建信息高速公路，推动经济增长”作为其竞选总统的口号。

1993年9月，克林顿政府推出“国家信息基础结构行动计划”，以互联网为雏形，兴建“信息高速公路”。

随后，日本、加拿大和欧洲等发达国家也纷纷提出了激励政策，加速建设“信息高速公路”。

在当今社会，信息经济已经成为国民经济发展最快的部门。

知识经济时代，经济增长源于知识的增长，成功的关键是要有足够的人力资本储备。

中国应该抓住机遇，推进国民经济信息化
3.知识和信息对社会的影响
提问：在知识经济中，知识和信息对社会的影响主要有哪些？学生阅读教材
后概括指出：在社会生产力的巨大发展、知识经济对劳动者素质的要求和信息技术促进了传统的产业的更新改造等方面发挥重要的推动作用。

然后教师指出：在知识经济中，知识和信息发挥了比传统经济更加重要的作用，它本身已经成为巨大的实际生产力。

互联网的发展，加速了知识的生产、传播和使用，知识对社会经济的作用日益加强。

据统计，在机械化程度低的情况下，体力劳动与脑力劳动的比例是9比1，中等程度机械化是6比1，全盘自动化是1比9。

信息工业是知识密集型工业，在信息社会里，价值的增加，主要靠知识。

体力劳动者和脑力劳动者的差别日益被脑力劳动者之间的差别所代替，“白领”、“蓝领”的差别正在逐渐消失。

信息技术也促进了传统产业的更新改造。

促进生产工艺的改进和管理水平的提高。

三、工作和生活方式的革命
互联网和人们的生产和生活紧密相连，互联网时代的到来引起了人们工作、学习和生活方式的革命。

互联网时代的到来引起了工作方式的革命。

互联网打破了时间和空间上限制，使世界更加紧密地连成一体。

在互联网时代，许多工作的办公地点可以选择在家中或者野外，办公场所的变化，既提高了工作效率，又增加了工作的乐趣。

互联网给人类的生活带来了革命性的变化。

互联网给我们自己生活带来的变化和极大的方便。

如在互联网时代，根据网上的求购信息，商店及时把货物直接送到消费者家中，银行则自动处理转账支付业务。

这就是所谓的“室内购货”和“室内银行”。

为人们提供了更多的交流和沟通的机会。

国际互联网还为教育提供了更大的发展空间。

作为人类最大的资源库、知识库，互联网引发了一场学习的革命。

随着信息高速公路的发展，信息技术在教育领域中广泛应用。

学生可以利用网络搜集相关资料，进行自主探究学习；教师可以通过各种教学录像、电视教育和人工智能课程来指导学生的学习。

网络使原先相对狭小的教育空间，变成了全社会的、开放性的教育空间。

互联网使远程教育成为可能。

四、面临的问题
国际互联网在给人类社会提供了更多的发展机遇地同时，也带来了巨大的挑战。

提问：互联网给人类社会带来了哪些巨大的挑战？学生阅读教材后概括指出：垃圾信息、网络安全、网络犯罪、对青少年心灵的影响等。

然后教师指出：以美国为首的西方大国，利用网络，传输西方资产阶级的意识形态、政治制度、文化思想，造成世界局势更加动荡不安。

国际互联网上色情信息泛滥成灾，虚拟社会使涉世未深的青少年不能自拔，严重影响了青少年的健康成长，都是互联网带给我们的巨大挑战。

【课后研讨】
随着科技的发展和人类文明的进步，互联网已经逐渐进入家庭，并深入人心。

只要条件允许，一台电脑，一根电话线就可以上网，互联网的生活逐渐影响并冲击着人们的传统生活方式。

要知道，当前的世界，互联网已经成为人类文明进步的标志，互联网信息已经成为人们了解世界、了解时代潮流的重要工具。

最近，央视的《焦点访谈》节目评论了一下互联网和互联网信息，在网友之间引起了相当广泛的争论。

那么，应该如何正确地看待互联网和互联网信息？
试结合你对互联网的认识，谈谈应该如何正确地看待互联网和互联网信息。

思路引领：充分理解、包容、使用互联网和互联网信息；正确地诱导、引导、使用互联网和互联网信息。

我们要正确地看待互联网和互联网信息，日本的前首。