限制性内切酶原理

DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制酶的催化 效率也有很大的影响。某些限制酶切割 超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶 量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最 高的可达20倍。
核酸内切限制酶的缓冲液
II型限制酶的最适pH一般是6-8, 缓冲液中通常含有Mg2+。
Star活性（星活性）
2
限制酶的种类
I型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能 准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。 II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识 别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种 类。例如：EcoRI、HindIII。 III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确 定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
粘性末端和平末端 II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端 分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶 在基因工程中应用最多。
5’NNNGTTAACNNN3‘ 3’NNNCAATTGNNN5‘

5’NNNGCGGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGGCGNNN 5 ‘

5’NNNGTT 3‘NNNCAA
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC GAATATTC CTTATAAG
II型限制酶
ApaI BamHI BglII EcoRI HindIII KpnI NcoI NdeI NheI NotI SacI SalI SphI XbaI XhoI
识别序列： 5'GGGCC^C 3' 识别序列： 5' G^GATCC 3' 识别序列： 5' A^GATCT 3' 识别序列： 5' G^AATTC 3' 识别序列： 5' A^AGCTT 3' 识别序列： 5' GGTAC^C 3' 识别序列： 5' C^CATGG 3' 识别序列： 5' CA^TATG 3' 识别序列： 5' G^CTAGC 3' 识别序列： 5' GC^GGCCGC 3' 识别序列： 5' GAGCT^C 3' 识别序列： 5' G^TCGAC 3' 识别序列： 5' GCATG^C 3' 识别序列： 5' T^CTAGA 3' 识别序列： 5' C^TCGAG 3'
命名
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
切割频率 切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA 分子中预期的切割概率。可以估算该限制性 核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。 前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、 碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每 个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。 如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每 隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为 n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
限制性内切酶的保存
限制酶于-20℃用50％的甘油保存。
3 Ⅱ型限制酶在基因工程中的的应用
基因工程中常用的 工具酶有限制酶、DNA 聚合酶、DNA连接酶、 逆转录酶、碱性磷酸酶、 末端转移酶、甲基化酶。
双酶切法
将目的基因导入受体细胞前，需要用相同的限制酶将 目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对 的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最 后将连接好的重组载体导入细胞。


5’NNNGC-OH
p-GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG-p 5’NNNGC -OH
3’NNNCGCCGG
HO-CGNNN5 ‘ GGCCGC NNN3‘
HO-CGNNN5 ‘
碱性磷酸ຫໍສະໝຸດ Baidu酶
pAGCTTNN • • • NNA-OH HO-ANN • • • NNTTCGAp
DNA连接酶
Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入 甲基。一些限制酶（如BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ 等）的识别位点中含 GATC 序列。 有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切 割相应的序列，如 BclⅠ。有些限制酶对Dam甲基 化的DNA不敏感，如 BamHⅠ、Sau3AⅠ等。
甲基化酶对限制酶的影响： 1.修饰酶切位点。 构建 DNA 文库时，用 AluⅠ（AG↓CT） 和 HaeⅢ（GG↓CC） 部分消化基因组 DNA 后，将得到 的片段用 M.EcoRⅠ甲基化酶处理，然后加上合成的 EcoRⅠ 接头，再用 EcoRⅠ来切割时只有接头上的 位点可被切割，从而保护基因组片段。 2.产生新的酶切位点 有些酶只识别经过甲基化的序列。DpnⅠ 是依赖甲 基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 处理后形成 甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 DpnⅠ 位点。
AACNNN3’ TTGNNN5’
5’NNNGC 3’NNNCGCCGG
GGCCGC NNN3‘ CGNNN5 ‘
HaeⅠ的识别序列
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
5’NNGCGGCCGC NN3‘ 3’NNCGCCGGCGNN 5 ‘


5’NNNGC-OH
P-GGCCGC NNN3‘
基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目 的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么 办？ 通常是设计合适的PCR引物，让目的基因在 PCR扩增后，两侧含有酶切位点。 Hsp70A ：Ex-F 5' CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3' Nde I Hsp70A ：Ex-R 5' GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3' Not I
DNA的甲基化程度
识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会 严重影响酶的催化效率。 为避免这样的问题，在基因克隆中使用的质 粒DNA是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提 取的。
酶切消化反应的温度
不同的限制酶具有不同的最适反应温度。 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是 37℃，有些核酸内切限制酶的最适反应温度 低于标准的37℃，SmaI是25℃、ApaI是30℃； 有些高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、 BclI是50℃、MaelII是55℃。
1
限制酶的定义
2
限制酶的种类
II型限制酶
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Ⅱ型限制酶的应用
4
DNA甲基化酶
1
限制酶的定义
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序 列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类 内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为 使用。
限制性核酸内切酶 分布极广，几乎在所有 细菌的属、种中都发现 至少一种限制性内切酶。 细菌通过自身的限制酶， 破坏入侵的外源DNA， 从而保护自身。
限制酶在一些特定条件下使用时，识别位点 的特异性降低，可以把不同于正常识别的序列切 断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率， 根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同。 Star活性主要受低粒子强度、高pH值以及 过高的甘油浓度的影响。
限制性内切酶反应的终止
消化DNA样品后，需要钝化内切酶的活性，终 止反应。 方法： 1）65℃温浴5-10分钟，使酶失活。 2）加入EDTA除去酶分子的镁离子，是使酶失活。 3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。 4）用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。
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DNA甲基化酶
甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲 硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可 形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。 DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体， 将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。
原核生物的 甲基化酶是作为 限制与修饰系统 中的一员，用于 保护宿主 DNA 不被相应的限制 酶所切割。
DNA的纯度
限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程 度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂 中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、 SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制 酶的活性。 提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一 般采用三种方法： ①增加限制酶的用量。 ②扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑 制因素被相应地稀释） ③延长酶催化反应的保温时间。
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
同裂酶 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷 酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切 割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但 切割位点不同的叫同序异切酶。 例如：HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。 XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但 Xma I的切点在C^CCGGG，形成带有CCGG的粘 性末端；而Sma I的切点则在CCC^GGG，形成平 末端。
3’NNNCGCCGG-P
HO-CGNNN5 ‘
3’粘性末端
5’NNGGTACCNN3‘
3’NNCCATGGNN 5 ‘

5’NNGGTAC-OH 3’NNC-P
P-CNN3‘
HO-CATGGNN 5 ‘
同尾酶 切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末 端的一类限制性内切酶。
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
可以有效防止载体自连造成空载体。
HindIII
BamHI
连接酶
单酶切法
可不可以用一种酶切割目的基因和载体？
可以，此时切割后的载体需要加入碱性磷酸酶处理。 碱性磷酸酶可以去除酶切后切口的磷酸，从而使粘性末端 在加入连接酶后不能重新结合。
5’NNNGCGGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGGCGNNN 5 ‘
特殊的II型限制酶 有些限制酶识别的序列不是回文序列。
AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
影响限制性酶活性的因素 1) 2) 3) 4) 5) 6) DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 限制性核酸内切酶的缓冲液 Star活性（星活性）
HindIII HindIII BamHI
• • • NNAAGCTTNN • • • NNGGATCCNNN • • • • • • NNTTCG AANN • • • NNCCTAGGNNN • • •
BamHI
AGCTTNN • • • NNG ANN • • • NNCCTAG
为什么通常要用两种限制酶？
限制酶的发现
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性 的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制 性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可 摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限 制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可 在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片 段。