彗星实验

Comet Assay 彗星分析系统

软件功能:

彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.

Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。

测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能

同时提供对双染色系统的分析

系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等

单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性

彗星试验：原理、应用和局限性

1. 前言

过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。

2.检测原理和检测指标

2.1 背景

二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。当加入嵌入剂溴乙锭时，负超螺旋松散，环状结构从类核核心伸展开来，形成一个晕圈。同样，用电离辐射来破坏环状结构时可发现相似的效应，单链断裂就足以使超螺旋松散。

彗星试验最常用的形式是细胞被包埋于琼脂糖中后，用去污剂和浓盐溶解，这样DNA就被固定，用于继后的电泳。彗星试验最早由Ostling 和Johanson阐述，他们参考Cook 等的类核模型，用松散的超螺旋的DNA对彗星尾巴加以描述，事实上，彗星尾巴可被简单的看作被电场拉向一边的晕圈。Ostling 和Johanson采用低于10的PH值。值得一提的是，尽管我们现在采用最多的是碱性SCGE,但对于检测单链断裂，并不需要在高PH下进行。

2.2常用的彗星试验形式

2.2.1碱性单细胞凝胶电泳

Ostling 和Johanson的试验方法并没有被广泛采用。几年以后，两个研究组独立的提出了包括在高PH 下处理的方法，Singh等在PH为10的情况下用2.5M Na Cl、Triton-100和十二烷基肌氨酸钠溶解细胞1h，然后用碱(0.3M NaOH)处理，在高PH（>13）的情况下电泳。Olive等在电泳前用弱碱(0.03M NaOH)溶解细胞1h。于是, 彗星试验被看作是和碱性解旋、碱性洗脱、碱性蔗糖沉降同类，为了

把DNA断裂暴露出来，都必需用碱性变性来把DNA双链同DNA断链区分开来。用碱是使彗星尾巴更显著，在不影响其灵敏度的情况下提高检测的分辨率。Ostl ing 和Johanson利用这种方法，检测了从1Gy 到3 Gy之间的电离辐射的效应, Singh等报告在0.25到3 Gy 范围内彗星尾长增加。

2.2.2中性单细胞凝胶电泳

在上述方法发现后，用中性方法检测低水平DNA断裂能力的另外一种方法被提出。在一段时间的碱性处理后，恢复条件至中性后再电泳。这一改变降低了其敏感性，扩宽了其应用范围，但仍用于检测单链断裂。

为了能排除单链断裂的干扰方便的检测双链断裂，Olive等提出了一种完全不同的中性彗星试验。他们的方法采用了在50℃的琼脂糖长时间处理溶解细胞，在这种情况下核基质可能被破坏，从而真正的观察DNA双链断片（或这些断片的游离末端）。

2.2.3对损伤特异酶类的使用

检测DNA断链只能给出有限的信息。一些损伤剂可能直接引起DNA断裂，但通常它们会很快重新连接起来。事实上它们可能只是脱嘌呤/脱嘧啶位点（即AP 位点或无碱基糖），因其在碱性条件下不稳定，所以看似断片。他们也可能是细胞内修复的中间产物。因为核苷酸和碱基切除修复过程都是切掉损伤并用正确的碱基予以替换。为了在提高灵敏度的同时提高特异度，我们介绍了用可产生特定损伤或断裂的酶来消化类核的额外步骤。因此,核酸内切酶Ⅲ用于检测氧化的嘧啶，甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶（FDG）用于检测主要的嘌呤氧化产物8- 羟基鸟嘌呤和其它改变了的嘌呤,T4核酸内切酶V用于识别UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体，Alk A在3-甲基腺嘌呤端切割DNA。上述实例中，DNA断裂频率增加则彗星尾部强度增加。

在过氧化氢处理过或加有光敏剂用可见光处理过的细胞中，用核酸内切酶Ⅲ或F DG很容易检测出氧化碱基。这种氧化的碱基在正常人淋巴细胞中也有一定数量的发现。

2.3 不太常用的彗星试验形式

2.3.1 5溴-2脱氧尿苷标记检测复制DNA

和DNA复制有关的DNA断裂将使彗星尾长增加，然而，用这种方法不可能辨别出S期和非S期细胞——可能是因为在某一时间参与复制的DNA数目极少，或因为复制装置用某种方法稳定复制叉，使这种断裂和正常的损伤断裂不同。如果在复制期间用5溴-2脱氧尿苷（BDdR）来标记细胞，然后用抗5溴-2脱氧尿苷抗体显色，可观察到带有标记的彗尾，后5溴-2-脱氧尿苷标记期间DNA复制的成熟导致标记物质重新进入头部。

2.3.2 检测DNA修复的中间物