几种常用植物病原细菌分子检测方法

专论与综述

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收稿日期:　20060220 修订日期:　20060418

基金项目:　国家自然科学基金项目(39970481);国家“863”计划项目(2001AA249021)3通讯作者E 2mail :jhguo @

几种常用植物病原细菌分子检测方法

尹燕妮,　黄艳霞,　葛芸英,　郭坚华3

(南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室,南京　210095)

摘要　植物病原细菌(phytobacteria )是植物上一类重要的病原菌,这些细菌能引起多种农作物、经济作物、花卉、树木及牧草上的病害。它的快速检测是病害防治、预测预报及植物检疫必不可少的重要工作。其中,以PCR 为基础的分子检测技术的进步使植物病原细菌的检测更快速、灵敏和可靠。本文对近年来植物病原细菌分子检测技术进行介绍,尤其是应用广泛的ITS 2PCR (intergenic transcribed space 2PCR )、ARDRA (amplified ribosomal DNA restric 2

tion analysis 2PCR )、rep 2PCR (repetitive DNA 2PCR )和实时荧光定量PCR (real 2time quantitative PCR )技术,旨在促

进我国植物病原细菌研究的快速发展。关键词　植物病原细菌;　分子检测;　PCR 中图分类号　S 432.42

Molecular diagnostic techniques for several commonly used phytobacteria

Y in Yanni ,　Huang Yanxia ,　Ge Yunying ,　Guo Jianhua

(Key L aboratory of Monitoring and M anagement of Plant Diseases and Pests ,M inist ry of A g riculture ,N anj ing A g ricultural Universit y ,N anj ing 210095,Chi na )

Abstract Phytobacteria are widespread and economically important plant pathogens.These bacteria cause severe diseases on many important plants such as field crop s ,economically important crops ,flowers ,trees ,and pasture.Rapid detection of phytobacteria provides a better f ramework for addressing important plant disease problems related to diagnosis and prediction of diseases ,and ultimate management of disease risks.The technology 2driven advances in PCR 2based methods make the detection of bacterial pathogens more rapid ,sensitive and reliable.In this paper ,the molecular diagnostic techniques were introduced ,especially ITS 2PCR ,ARDRA ,rep 2PCR and real 2time quantitative PCR techniques.It was aimed to promote the research of phytobacteria in China.K ey w ords plant pathogenic bacteria ;　molecular detection ;　PCR

传统病原细菌检测方法主要是依据症状、形态、生理生化反应和血清学等方法。这些方法耗时费力,且稳定性不高,不能直接从植物组织中检测出病原细菌。20世纪80年代基于细菌染色体分子检测方法的出现,尤其是PCR 方法的诞生及计算机辅助分析,使细菌的快速检测成为可能。细菌的分子检测方法大致可以分为非依赖PCR 及依赖PCR 两大类。非依赖PCR 的方法有两种,一种是全基因组DNA 2DNA 同源性比较或复性动力学,该方法较粗

略,现在一般不采用;另一种是限制性片段长度多态性(rest riction f ragment lengt h polymorp hism ,RFL P )分析,该技术存在操作繁琐、放射污染等缺

点,且细菌基因组较真核生物小,酶切后多态性不丰富,所以该方法一般不单独使用。PCR 是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术,以下主要介绍依赖PCR 的几种常用的检测方法。

1　ITS 2PCR

ITS 2PCR 分析是利用保守的16S rDNA 和23S

rDNA 序列,设计引物扩增转录间隔区(ITS )。16S rDNA 和23S rDNA 间的ITS 区域包括一些t RNA

基因和非编码区域。由于面临较小选择压力,ITS 区域比16S rDNA 和23S rDNA 的多态性丰富。使用通用引物扩增ITS 区域后,通过产生带的长度可

以确定细菌的种类。ITS区域经PCR扩增后的产物经限制性酶切分析(rest ricted enzyme analysis, REA)或DNA序列分析都可加强其特异性。

Mase等用一对与ITS内部序列结合的引物扩增出半透明黄单胞菌(X ant homonas t ransl ucens)致病变种DNA,得到一段特有的139bp片段;选择4种黄单胞菌的16S223S间隔区进行序列比较分析,设计出的引物可以特异地、灵敏地检测出谷类种子中的条斑病菌[1]。葛芸英等通过2种病原菌的16S2 23S rDNA的ITS序列分析,设计出的特异性引物,完成了小麦苗枯病菌(Cl avibacter f angii)[2]和甜菜银叶病菌(Curtobacteri um f l accum f aciens pv.bet2 icol a pv.nov.)的检测[3]。付鹏等利用特异性引物ClaF12ClaR2对番茄溃疡病菌的ITS区域扩增,得到250bp的片段[4],参试的其他棒形细菌及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强,灵敏度高,在50p g的模板浓度下能检测到很强的条带,利用此引物可检测到1×105个菌体。

2　AR D RA

扩增核糖体DNA限制性酶切分析(ARDRA),利用通用引物扩增rDNA序列,然后用内切酶限制性切割消化(restriction endonuclease analysis, REA)后,得到的多态性谱带可用于属水平或种水平上细菌菌株的鉴定和分类。ARDRA比16S rD2 NA测序更为快速,尤其是产物经荧光标记后可进行自动分析。通过A RDRA产生的16S rDNA片段图谱和rep2PCR产生的基因组指纹图谱结合起来分析,可进一步鉴定到亚种甚至菌株的水平。同样来自于16S rDNA区域、ITS区域或任一种其他的图谱都可与A RDRA产生的图谱结合起来进行计算机辅助分析。

另一种ARDRA方法是末端限制性酶切长度多态性分析(terminal2rest riction f ragment lengt h pol2 ymorp hism,T2RFL P)。此方法依据不同系统发育组内16S rDNA扩增产物的末端限制性片段长度具有特异性,5’端的引物经荧光染色,在限制性酶切16S rDNA片段后,末端片段可以被特异性地检测出来并可确定其长度。

将真细菌中的保守序列设计出引物(fD2和r P1),对Erw i ni a am y lovora扩增得到的1.5bp的16S rDNA片段,经H aeⅢ酶解后得到具有鉴别意义的RFL P图谱[5]。一种嵌套式16S rDNA2PCR 的方法可以特异性地鉴定密执安棒形杆菌(Cl avi2 bacter michi ganensis),在限制性酶切分析后可区别不同的亚种[6]。通过对扩增产物的REA加强其特异性的方法一般称为PCR2RFL P,有人认为4个识别位点的限制性内切酶效果较好。

利用rDNA作为靶目标检测病原细菌,其辨别力一般只能达到种或属的水平。许多rDNA的PCR引物之通性被广泛用于其他更为特异的PCR 方法的设计,例如应用广泛的ITS2PCR,A RDRA 等。tDNA一般位于16S和23S rDNA间的ITS区域或细菌5S rDNA末端。由于编码tDNA基因同源性最高,通用引物可从动植物和细菌的细胞核或细胞器中扩增出DNA片段,不能单独用于病原菌的检测。

除利用核糖体DNA来检测病原菌之外,还可通过质粒DNA、致病基因和未知DNA序列来进行检测。利用质粒DNA时需考虑其稳定性,除非此质粒是编码适应性或致病性的基因。由于细菌的质粒在某些环境中易丢失,导致检测结果的可靠性降低,因此质粒只适合对某些特殊病原菌的检测。于致病性相关的基因既有限又较难获得,因此这些基因在检测中的应用受到限制。未知的DNA序列可用来设计PCR的引物,通常可以确定特定种的特有片段。但这样的目标序列不能用于长期、稳定的检测,且此序列发生的突变也无法观察到。

3　rep2PCR基因指纹图谱分析

rep2PCR是在细菌基因组内特殊的保守重复序列被发现后发展起来的一种技术。应用较多的序列为:基因间重复性回文序列(repetitive extragenic pal2 indromic,REP);肠细菌重复性基因间共有序列(re2 petitive intergenic consensus,ERIC);BOX元件。这些序列作为PCR反应的引物,扩增两个相邻重复元件之间的DNA序列。细菌基因组可产生一系列复杂的片段(10到30或更多),长度短到200bp,长达6kb。这3种方法分别被称为REP2PCR,ERIC2PCR,BOX2 PCR,总称rep2PCR。rep2PCR技术能在种、致病变种(生化型)、菌株水平上区分和鉴定植物病原细菌,也可用于测定病原菌的群体遗传多样性,从而有助于揭开病原菌的起源、进化和系统发育关系,为病害的监测与防治提供重要的信息资料和科学依据。每一种引物(REP,ERIC和BOX)都可用于革兰氏阳性、阴性菌及与植物有关的放线菌等所有细菌的指纹图谱分