乙肝两对半操作规程

免疫室乙肝两对半操作规程

一、试验原理

“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBSAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）此五项指标，目前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，判断是否感染乙肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下： 1、乙型肝炎病毒表面抗原检测：

采用ELISA“双抗体夹心法”原理，用抗-HBs包被板条，用HRP 标记抗-HBs为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBSAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBSAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAg。

2、乙型肝炎病毒表面抗体检测：

采用ELISA“双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗-HBS,采用HBSAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBSAg-HRP进行孵育。当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSAg结合并与酶结合物形成HBSAg-抗-HBS-HBSAg-HRP复合物，洗去游离反应物，加入显色剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。

3、乙型肝炎病毒e抗原检测：

采用ELISA“双抗体夹心法”检测，用单抗-HBe包被板条，用HRP标记抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在HBeAg时，该HBeAg与包被抗-HBe结合并与抗-HBe-HRP结合形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBeAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAg。

4、乙型肝炎病毒e抗体检测：

采用LEISA“中和竞争法”检测抗-HBe，用单抗-HBe包被板条，用HRP标记的多抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。加入待测的标本，同时加入基因工程HBeAg和多抗-HBe-HRP,当标本中抗-HBe含量高时，则抗-HBe-HRP与HBeAg结合后形成游离物被洗涤掉，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。在试验结束时，无颜色或颜色变化微弱的，提示有抗-HBe存在，显色深时，则提示不存在抗-HBe。

5、乙型肝炎病毒核心抗体检测：

采用ELISA“竞争抑制法”检测抗-HBc，用基因工程重组HBcAg 包被板条，用HRP标记的抗-HBc为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。加入待测标本，同时加入抗-HBc-HRP,与抗原形成竞争结合，当标本中抗-HBc含量高时，则抗-HBc-HRP与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之显色深。在试验结束时，无颜色或颜色变化微弱的，提示有抗-HBc存在，显色深时，则提示不存在抗-HBc。

二、样本要求

1、无需空腹，可血清或血浆标本；新鲜标本无菌冷藏１周可用；

可冷冻保存，但避免反复冻融。样品中含叠氮钠会影响结果；高度溶血或没完全收缩的血清样品或有微生物污染的样品可能会引起错误的结果。

2、试剂：我室“乙肝两对半”检测试剂盒由上海荣盛生物药业有

限公司提供

3、设备：洗板机1台、酶标仪1台、微量振荡器1台、打印机1

台、加样器1把、吸嘴（50-250ul）

三、操作步骤

1、试剂盒准备

试剂贮存在2-8℃冰箱，实验前应提前30min取出，使其恢复至室温，待用。

2、加样

（1）准备实验所需反应孔在以上实验原理中可以看出“乙肝五项”中每个项目必须对应各自反应孔，不可错位摆放，否则直接导致错误报告发出。

（2）乙肝表面抗原：第一步，先加样本100ul，温育30-40min；

第二步，加酶结合物50ul（1滴），温育30min，洗板10次，加显色剂A/B各1滴显色看结果。

具体步骤：采用“两步法”，结果需用酶标仪比色，读取OD值。

每次试验，每块表面抗原测试板均需要设空白孔1孔、阴性对

照孔2孔、阳性对照孔1孔、质控（最低值）孔1孔。

A：样品（阴性、阳性、质控）各100ul，加入各自对应的反应孔中，封板、温育30-40min

B:加酶结合物1滴（瓶身垂直滴加，挤掉前面有气泡成分），振荡混匀30″，温育30min

C：洗板10次（最好中间有一次手动拍板），自来水冲洗3-5遍，拍干

D：加显色剂A、B液各1滴，避光显色15min，加终止液1滴，酶标仪上比色

E：结果判读

临界值（Cutoff）=阴性对照平均OD值×2.1

（阴性对照OD值<0.05，按0.05计算；大于0.05按实际值算）样本OD值>Cutoff值为阳性，

(3）表面抗体

（4）e抗原

（5）e抗体

（6）c抗体

此四项具体操作步骤大致相同，均为“一步法”，因未上酶标仪比色，无需做阴阳性对照，如下：

D1：取所需反应孔，加样50ul

D2：加各自对应酶结合物1滴（50ul），注意：“乙肝e抗体”检测（以上海荣盛试剂为例），在加完样本后，先加“中和试剂”

1滴，再加“酶结合物”1滴，不可漏加

D3：振荡充分混匀，各温育30min

D4：洗板5次，流水冲洗1-2遍，拍干板孔

D5：加显色剂A、B各1滴（50ul），避光显色15min

D6：结果判读（肉眼）

SAg、eAg：显色（蓝色）为阳性，不显色为阴性

eAb、cAb：显色（蓝色）为阴性，不显色为阳性

严格意义来说，严格按照试剂盒说明书来操作更好。须注意“乙肝核心抗体”标本要作1：30稀释，血清中若检测到低滴度的抗HBC,往往只表明既往感染，有流行病学意义，只有检测到高滴度抗体（1：30）或连续检测抗体滴度升高，才作为感染指标。

3、报告模式

1、1.3.5

2、1.4.5

3、1.5

4、2.5

5、2.4.5

6、2.4

7、2

8、5

9、4.5

10、全阴

四、注意事项

1、标本尽量新鲜，血清待完全析出，避免溶血或有污染的标本