荧光分析

可 能 发 生 T1→S1， 然 后 由 S1 发 生 荧 光。这是产生延迟荧光的机理。
S0 吸光λ1
S1
T1
吸光λ2 荧光λ3
荧光、磷光 能级图
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辐射能量传递过程：
荧光发射
处于第一激发单重态中的
电子跃回至基态各振动能级 时，将得到最大波长为λ3的荧 光。注意：基态中也有振动驰 豫跃迁。很明显，λ3的波长较 激发波长λ1或λ2都长，而且不 论电子开始被激发至什么高能 级，最终将只发射出波长λ3为 的荧光。荧光的产生在10-7-10-9 s内完成。
S2
S0 吸光λ1
S1 T1
吸光λ2
荧光λ3
荧光 荧光、磷光 能级图
磷光发射
电子由基态单重态激发至第一激发 三重态的几率很小，因为这是禁阻跃 迁。但是，由第一激发单重态的最低 振动能级，有可能以系间窜跃方式转 至第一激发三重态，再经过振动驰 豫，转至其最低振动能级，由此激发 态跃回至基态时，便发射磷光，这个 跃 迁 过 程 （ T1→S0） 也 是 自 旋 禁 阻 的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。 因此，这种跃迁所发射的光，在光照 停止后，仍可持续一段时间。
= Cs I fx − I f 0 I fs − I f 0
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第三节 荧光分光光度计和荧光分析新技术
一、荧光分光光度计 用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、
用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检 测器四部分组成。
由光源发射的光经第一单色器得到所需的激 发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物 质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。
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荧光计示意图
光源 第一单色片 第二单色片
样品池
光电管
显示器
********
荧光分析法的特点
1、优点 （1）灵敏度高，比紫外可见分光光度法高2-4个数量级，一般
可达10-10-10-12g/mL。 原因a. 荧光信号是在暗背景下检测的
b. 提高激发光强度可增大荧光强度 （2）选择性好
指出，处于高激发单重态的电 S0
子，通过内转移及振动弛豫， 均跃回到第一激发单重态的最 低振动能级。
吸光λ1
吸光λ2
荧光、磷光 能级图
系间窜跃
系间窜跃
指不同多重态间的无辐射跃
迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。
S2
通常，发生系间窜跃时，电子由S1
的较低振动能级转移至T1的较高振
动能级处。有时，通过热激发，有
激发单重态S与激发三重态T的不同点： ⑴ S是抗磁分子，T是顺磁分子
⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s；(发光速度很慢) ⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，
基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁； ⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低
8
8
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式 再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发 射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振 动弛豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转 移（EC）等．
一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。
一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶 剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起荧光光谱的 移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由于溶质 分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶 剂中的荧光
图为 不同温度下邻菲啰啉的 荧光光谱（在邻二甲苯中）
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3、溶液pH值对荧光强度的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的 pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合 物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度 和荧光光谱就有一定的差别。
对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面pH会影响 鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们的 荧光性质。 下列为两个实例:
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4、其它方面影响
表面活性剂的存在对荧光光谱及强度都会产生影响。荧 光体在由表面活性剂形成胶束的微环境中，不仅可以减少非 辐射去激化过程和猝灭过程的速率，提高荧光量子产率，而 且由于表面活性剂参与组成配合物而增大分子的有效吸光截 面积，导致摩尔吸光系数的增大。因此，在胶束溶液中，荧 光强度增强，测定的灵敏度提高。多元配合物的形成通常也 可以增强荧光强度，提高荧光测定的灵敏度。
如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧 光物质的电荷状态改变，则荧光峰位和强度都会发生 较大的变化。
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2、 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部
能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发 能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能 量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。
M + Q = MQ（非荧光物质）
Kf
= C(MQ) C(M )C(Q)
经推导得出： 猝灭剂加入前
I前 I后
=1+
K f C(Q)
的荧光强度
猝灭剂加入后试
液的荧光强度
常数 猝灭剂浓度
I前/I后与C（Q）有线性关系，可求猝灭剂含量
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与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分 别加入一系列不同量的猝灭剂 Q ，配成一个荧光 物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们
同时利用激发光谱和发射光谱对物质进行鉴定 （3）用量少 （4）提供较多的物理参数（e.g.激发光谱、发射光谱、荧光强
度、总荧光量、量子产率、荧光寿命、荧光偏振），可用由 此得到被测物质的更多信息。
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2、缺点 （1）应用不够广泛
非荧光物质难以直接测定。 （2）精密度、准确度比吸光度差
荧光对环境因素敏感，如温度、溶剂、溶液pH、散 射光等都能影响荧光的测定。
b--吸收光程
ε--摩尔吸光系数
C--荧光物质浓度
IP----磷光强度
φP-----磷光量子产率
I0--入射光强度。
当入射光强度I0 和b 一定时，上式为：
IF = K C
定量分析依据
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定量分析方法
定量分析依据
If = KC
Ip = KC
1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法
将已知量的标准物质与试样在相同条件下处 理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光 强度。
32
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二聚体或称双体、基本涵 义都表示相同或同一种类的物 质，以成双的型态出现，可能 具有单一状态时没有的性质或 功能。
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第二节 荧光定量分析方法
溶液的荧光（或磷光）强度
1. 荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率ϕ 。 If = ϕ Ia
式中ϕ为荧光量子效率，又根据Beer定律
S2
S0 吸光λ1
S1 T1
吸光λ2
磷光
荧光λ3 荧光、磷光 能级图
磷光
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外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能
量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为 “熄灭”或“猝灭”。
15
分子荧光与磷光的产生
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（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线
18
激发光谱与发射光谱的关系
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（三）荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才
能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有
一定的荧光量子产率。
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三、荧光强度的影响因素
1、 溶剂对荧光强度的影响 溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。
Ia = I0 - It = I0(1- e -ε l C)
I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得
If = ϕ I0(1- 10 -ε l c) = ϕ I0(1- e -2.3ε l c)
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对于稀溶液，当ε bc<0.05时：
IF = 2.30φFI0εb C
IF----荧光强度
φF-----荧光量子产率
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非辐射能量传递过程：
S2
S1
T1
振动弛豫
S0
吸光λ1
吸光λ2
荧光、磷光 能级图 → 振动弛豫
振动弛豫
在同一电子能级中， 电子由高振动能级转 至低振动能级，而将 多余的能量以热 的形 式发出。
内转移
内转移
当两个电子能级非常靠近
S2
以至其振动能级有重叠时，常
S1 T1
发生电子由高能级以无辐射跃
迁方式转移至低能级。右图中
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第一节 荧光分析法的基本原理
（一）分子荧光的产生
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分 子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而 三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
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基态单重态S
激发态单重态S
激发态三重态T
较高激发态
吸收能
量受激 基
态
光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
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根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为 以下几类：
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
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分子发光分析法及其分类
某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态 跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基 态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起 来的分析方法为分子发光分析法。
第十一章 荧光分析法
岛津RF-5301PC荧光分光光度计
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概述
第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 色。
直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概 念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
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光谱可能会有显著不同。有的情况，增大溶剂的极 性，将使n→π∗跃迁的能量增大， π→π∗跃迁的能量减 小，而导致荧光增强，荧光峰红移。但也有相反的情 况，例如，苯胺奈磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、 乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小， 荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性 之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。
以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度
为横坐标
If
浓度
C1 C2 C3
荧光强度 If1 If2 If3
C4 C5 Cx Ifx If4 If5 Ifx
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Cx C
2. 荧光猝灭法
把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性
若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物
MQ
如果试样数量不多，可用比较法进行测量
配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度Cx相 近，并在相同条件下测定它们的荧光强度
未知液 标准液
If x = KCx 比较 If s = KCs
I fx = Cx I fs Cs
Cx = Cs I fx 若有试剂空白，测得的荧光强度减去空白后 I fs
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四、 荧光分析新技术简介
激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析
的荧光强度，得一曲线
取相同荧光物质 CM
加不同量Q
CQ0
测 If
I前
CM CQ1 I后1
CM CQ2 I后2
CM … CM CQ3 … CQx (CQ0 =0) I后3 … I后 x
计算 I前/I后
I前/I后1 I前/I后2 I前/I后3 … I前/I后x
I前/I后
I前/I后x
CQx
CQ
3. 比Leabharlann Baidu法——比较简单
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级
图λ 2 ,λ 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的
最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样） 成镜像对称关系。