猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用
猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用
ＰＣＲ ｓ ａ ｏ ｅ ｅ ｔ ｎ ０ ｙ ｏ ｌ ｓ ａ ｈ ｏ ｎ ｕ ｏｄ ｅ ａ ｄ ｉ ａ ｓ ｙ ｆ ｒ ｄ ｔ ｃ ｉ ｆＭ ｃ ｐ ａ ｍ ｙ ｐ ｅ ｍ ｒ ａ ｎ ｔ ｏ ｓ
（ Ｓ ａ ｄｉ ｌ ｉａ ａ ｐｉ ｔｎ ． ａ ｆ ｒ ｅ ａ ｅｉ ｅ ｒｔｅｄｔｃ ｏ ｆＭ ｅｐａｍａｈ ｏｎｕ ｏｉｅ（ ｐ ＭＰ ） ｎ ｓｃ ｎｃ ｐ ｌ ａ ｏｓ Ａ ｐ ｉｏ ｉ ｒ ｓｄｓ ｎｄｆ ｅ ｔｎ ｏ ｙｏｌｓ ｙｐ ｅ ｍ ｎａ Ｍｈ） ｔ ｉ ｌ ｃｉ ｒ ｐｍ ｗ ｇ ｏ ｈ ｅｉ
ｄ ｔｃ ｉｎ ｏ ｐ ｗａ ｅ ｅｏ ｅ ．Ｉ ｗ ｓ ｆｕ ｄ ｔ ａ ４ ｐ ｏ ｐ ｓ ｅ ｉ ｃ ｂ ｎ ａ ｅ ａ ｌ ｅ ｎ ． ３ ｇ ｏ ｐ ｅｅ ｔ ｆＭｈ ｓ ｄ ｖ ｌｐ ｄ ｔ ａ ｏ ｎ ｈ ｔ９ ８ ｂ ｆＭｈ ｐ ｃｆ ａ ｄ ｃ ｎ ｂ ｍｐ ｉ ｄ ａ ｄ ０７ ５ ｎ ｆＭｈ ｏ ｉ ｉ ｆ Ｄ ＮＡ ａ ｅ ｄ ｔｃ ｅ ｙ ｔ ｅ Ｐ Ｒ ｓ ａ ，ｗ ｔ ｏ ｏ ｓ ｒ ａｉ ｎ ｏ ｈｅ ｃ ｎ ｂ ｅｅ ｔ ｄ ｂ Ｃ ａ ｓ ｙ ｉ ｎ ｂ ｅ ｖ ｔ ｆ ｔ Ｍｙ ｏ ｌ ｓ ａｌ ｅ ｔ ｕ ｈ ｈ ｏ ｃ ｐ ａ ｍａ ｇ ｌ ｓ ｐ ｉ ｍ，ｐ ｅ ｄ ｒｂ ｅ ｖｒ ｓ ｉ ｃ ｓ ｕ ｏ ａ ｉｓ ｉｕ ， ｅ ｒ ｏ ｉ ， ｗ ｎ ｆ ｅ ｚ ｉｕ ， ｏ ｃｎ ｅ ｒｄ ｃ ｉｅ ａ ｄ ｒ ｓ ｉ ｔｒ ｙ ｄ ｏ ｉ ｓ Ｔ ｅ ｈ ｍｏｏ ｙ ｏ ｌｎ ｄ ｆ ｇ ｎ ａ ｉｃ ｖｍｓ ｓ ｉ ｅ ｉ ｌ ｎ ａ ｖｒ ｓ ｐ ｒ ｉ ｅｒ ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｅ ｐ ｒ ｏｙ ｓ ｎ ｒ ｍｅ ｖｒ ． ｎ ｕ ｖ ａ ｕ ｈ ｏ ｌ ｇ ｆｃｏ ｅ ａ ｍｅ ｔ ｓ ｒ ｗ
猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用
保健科 技 公 司 提 供 （ 号 ０４４ １ ， 小 病 毒 核 酸 批 ０ ００ ） 细 模板 分离 自细 小 病毒 血 清 检测 阳性 病 猪 组 织 ， 料 病 采集 于 临床 表现 体温 升 高 ， 呼吸 困难 ， 腹泻 的 患病断 奶仔 猪 及 呼 吸 困难 、 殖 障 碍 的母 猪 和 流 产 胎 儿 。 繁
１ ２ 引物 设 计 和 合 成 根 据 Ｎ Ｂ ． Ｃ Ｉ中 已登 录 的
反 应体 系 中 ， 上 下游 引 物 （０ｕ ｏ Ｌ 各 ０ ５ ｌ 含 ２ ｍ ｌ ） ｆ ． ，
ｄ Ｔ （ ０ｍ Ｎ Ｐ １ Ｍ）０ ５ ｔ ， “ １ ５ ｔ ，０×Ｐ Ｒ ｂ ｆ ． ｘ Ｍｇ ． ｘ １ ｌ ｌ Ｃ ｕｅ ｉ
至研 钵 内 ， 研磨 ５～１ ｎ 倒 人 １５ｍ 离 心管 内 ， ０ｍｉ后 ． ｌ 在 一 ０ 冻融 ２次 ，００ｒｍｉ ２℃ ５ ０ ／ ｎ离心 ５ｍｎ 备用 。 ｉ， １４ Ｄ Ａ抽 提 （ 照 Ｑ Ａ Ｅ ． Ｎ 参 ＩＧ Ｎ试 剂盒说 明书 ） 吸
取 ２０Ｉ 经 处 理 的 组 织 样 品 至 １ ５ｍ 离 心 管 中 ， ０ ｌ ｘ ． ｌ
病 毒病 检测 方 法 。
１ 材 料 与方 法
加人 １０ ｔ Ｔ ８ ｘ Ａ Ｌ液 ； 人 ２ ｌ蛋 白 酶 Ｋ， 旋 ， ｌ 加 ０ 涡 ５ ℃ 孵化 ｌ～ ， 时 涡 旋 （ 夜 效 果 更 好 ） ５ ３ｈ 不 过 ；涡 旋 １ ，加 ２０ Ｉ Ｌ液 ，充 分 涡 旋 ，７ ℃ 水 浴 １ ５Ｓ ０ ｘ Ａ ｌ ０ ０ ｍｎ 加 ２０Ｉ 元 水 乙 醇 ， 分 涡 旋 ； 离 心 管 中液 ｉ； ０ ｌ ｘ 充 将
维普资讯
一步法RT—PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法建立及应用
Ｐｏ ｃ ｎ ｐｒ ｄｕ ｔｖ ｎ ｓ ｉａ ｏ ｙ Ｓ ｎ ｏ ｒ ｓ ｒ ｉ ｅ Ｒｅ ｏ ｃ ｉ ｅ ａ ｄ Ｒｅ ｐ ｒ ｔ ｒ ｙ ｄｒ ｍｅ Ｖｉ ｕ
Байду номын сангаас
Ｃ Ｉ ｉ ａ ｇｅ ａ． Ａ —ｇｎ ｔ １ Ｑ （ ｉｇａ Ａ ａｅ ｙｏ ｎｍ ｎ ｅ ｒ ａ ｃ ｎｌ， ｉｉｇ８ ０ １ ） Ｑ ｎｈ ｉ ｃｄ ｍ ｆ ｉ ａａ ｄＶ ｔ ｉ ｒ Ｓｉ ｃ Ｘｎｎ １０ ６ Ａ ｅｎ ｙ ｅ ｓ
摘 要： 根据 Ｇ ｎ Ｂ ｎ 公 布的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（ Ｒ Ｓ 美洲型毒株 Ｖ ２ ３ ｅｅ ａｋ Ｐ Ｒ Ｖ） Ｒ一 ３ ２序列 设计了一对特异 性引物 Ｐ ／ ２ 扩增片段为 ５ ８ ｐ 从 而建立 了检 测 Ｐ Ｒ Ｖ的一步法 Ｒ Ｐ Ｒ蛤测方法 ， 异性试验 表明 ， 引物均不 １Ｐ ， ０ｂ ， ＲＳ Ｔ— Ｃ 特 该 能扩增 其它常 见的与 繁殖障碍有关 的病毒基 因。敏感性实验 表明 ， 引物可 以检测到 １ ～Ｔ Ｉ 的病 毒含量 。利用 该 该 ０ ＣＤ 。 方法对青海某猪场 中 ２ ０份临床上疑似 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ的组织进行检测 ， 中 ｌ 其 ６份样品呈 Ｐ Ｒ Ｖ阳性结果 ， ＲＳ 阳性率 为 ８ ％ ， ０ 表明 建立的该方法完全可 以快速检测组 织中的 Ｐ Ｒ Ｖ。 Ｒ Ｓ 关键词 ： 猪繁殖 与呼 吸综合征 ； 病毒 ； Ｔ— Ｃ Ｒ Ｐ Ｒ； 中 图分 类 号 ：８ １４ ￥ ５ ． 文 献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ３７５ （０ ０ ０ －０４０ １０ －９ ０ ２ １ ） １ ０ －３ ０ Ｅｓａ ｉｈ ｅ ｎ ｐｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｓｅ ＲＴ． ｔ ｂｌ ｍ ｎｔａ ｄ Ａｐ ｉ ｔｏ ｆ Ｏｎ ．ｔ ｐ ｓ ｃ ＰＣＲ ｔ ｃ ｅ Ｄｅ ｅ ｔ ｄ
猪病诊断和防治中PCR技术的应用
X u m u s h o u y i随着我国畜牧业的全面发展，带动了农村经济水平的提升。
在畜牧养殖过程中，最多的动物品种就是猪类养殖，面临着市场对猪肉食品需求越来越大，我国猪类养殖规模不断扩大，为畜牧养殖企业和个体户带来了丰厚的收益。
但是在实际养殖过程中，猪病是影响健康养殖的主要因素，而诊断和防治技术是解决猪病的主要手段。
在现代科技的影响下，广泛采用了PCR猪病诊断技术，同时快速和精准的发现猪病的原因，找出病原菌，有利于进一步开展治疗。
一、PCR技术概述随着我国现代科技的发展，在畜牧领域中广泛引入了PCR 技术，并且在猪病诊断和防治工作中发挥出良好的作用。
其中，PCR技术凭借着操作简单，特异性强以及扩增效果俱佳等特点，在猪病诊断和防治中实现了全面推广与应用。
而PCR技术在实际运用中，可以达到快速扩散的效果，从而对微量基因进行全面监测，并在PCR技术的支持下，还会对寡核苷酸产生影响，而寡核苷酸也是靶序列的重要引物。
目前，我国PCR技术仍然不断突破，并在以往技术水平上实现了创新技术，提出了PCR荧光定量技术、RT-PCR技术以及PCR多重技术等新型技术手段，并在猪病诊断和防治中取得了良好的应用效果，具有重要的应用价值。
二、PCR技术在猪病诊断与防治中的实际应用1、猪2型环病毒中PCR技术的运用在我国猪类养殖活动中，猪2型环病毒属于一种微型动物病毒，结合以往的养殖经验分析，对于PCV1和PCV2血清来说，前者具有非致命性，而后者属于致病性病毒。
猪2型环病毒的临床现象一般会造成断奶仔猪的多器官衰竭综合征，如果为急性病种，那么致死率高达10%，同时对猪的生长发育也造成严重的影响。
对于这种猪病的防治来说，可以采用疫苗接种的方式进行预防，同时也可以使用抗生素类药物进行猪2型环病毒进行治疗。
结合该病毒的调查发现，这种病毒的基因序列设计引物是以临床分离出的病毒基因为模板，并在促进反映环境下，利用PCR技术准确的检测出猪2型环病毒ORF2基因，同时也能够展现出良好的特异性，具有较高的诊断率。
猪2型圆环病毒感染的PCR检测及甘肃株的同源性分析
猪2型圆环病毒感染的PCR检测及甘肃株的同源性分析猪2型圆环病毒（PDCoV）是一种对猪群健康产生严重影响的病毒，它引起了猪产业的巨大损失。
PCR（聚合酶链反应）是一种常用的病毒检测方法，可以快速、准确地检测出PDCoV的存在。
本文将介绍PDCoV的PCR检测方法以及对甘肃株的同源性分析。
首先，我们需要准备样品。
为了进行PDCoV的PCR检测，我们需要收集猪粪便等样品，并将其保存在适当的条件下，以确保样品中病毒的完整性和稳定性。
收集的样品应当来源于不同地点和不同时间的猪场，以保证样本的多样性。
接下来，我们需要提取样品中的病毒RNA。
病毒RNA提取是PCR检测的前提，它可以通过商业化的RNA提取试剂盒或自制方法来实现。
重点在于保证提取的RNA质量和纯度，以确保PCR反应的准确性和可靠性。
完成RNA提取后，我们可以进行PDCoV的PCR检测。
PCR反应是一种基于DNA聚合酶的体外扩增方法，可以将目标DNA的特定片段放大到可检测的浓度。
在这里，我们需要选择合适的引物和探针，以扩增并检测PDCoV的特定基因区域。
在PCR反应中，我们首先需要将提取的RNA反转录为cDNA，以便使用DNA聚合酶进行扩增。
接着，我们将cDNA与引物和探针一起放入PCR反应管中，进行PCR扩增。
PCR反应通常包含一个热启动步骤，用于激活DNA聚合酶，并一系列的循环步骤，包括变性、退火和延伸，以完成DNA片段的扩增。
扩增结束后，我们可以使用凝胶电泳等方法，检测PCR产物的存在与否。
通过凝胶电泳，我们可以观察到特定大小的PCR产物，从而确定猪样品中是否存在PDCoV。
在对PDCoV进行PCR检测后，我们可以进一步对甘肃株的同源性进行分析。
同源性分析可以帮助我们了解不同样品中PDCoV的遗传相似度，并揭示其传播途径和流行规律。
同源性分析通常使用序列比对和系统进化分析等方法。
首先，我们需要提取PDCoV阳性样品中的RNA，并通过逆转录为cDNA。
猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ Ｖ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ ｔ ｒｎ ｒ ｄ ｃｎｅ
猪 细 小 病 毒 、 狂 犬 病 病 毒 和 猪 圆 环 病 毒 ２型 伪 多重 Ｐ ＣＲ 检 测 方 法 的 建 立 及 应 用
测 方法可 用 于临床样 品 的检 测 ， 为疾病诊 断提供 参 考 。
关键 词 ： 细 小病 毒 ； 猪 伪狂 犬病 病毒 ； 圆环病毒 ２型 ； 猪 多重 Ｐ Ｒ Ｃ
中图 分 类 号 ： ８ ； ８ ８ ２ Ｑ７ ９ ￥ ５ ． ８ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７ ５ ３ （ ０ １ ０ — ０ ５０ １０ —０ ８ ２ １ ）８０ ２—７
的发 生 ， 如感染 仔猪 先天 性震 颤 、 奶仔 猪 多系 统衰 断
用方 法 ， 也为 养殖 企 业对 这 ３种 疫 病 的 防控 提 供基
础 资料 和参考 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
竭综 合征 和猪皮 炎 与肾炎 综合 征 等［ 。 ４ ］ 聚 合 酶 链 反 应 （ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅ ｃｉｎ ｐ ｌｍｅａｅ ｃ ａｎ ｒａｔ ， ｏ
Ｐ Ｖ） 伪狂犬 病病 毒 （ ｓｕ ｏａ ｉｓｖｒｓ Ｐ Ｐ 、 Ｐ ｅ ｄ ｒ ｂｅ ｉ ， ＲＶ） 猪 ｕ 、
圆环病 毒 ２型 （ ｏ ｃ ｅｃ ｃ ｖｒ ｓｔｐ ， Ｃ ２ 是 Ｐ ｒｉ ｉ ｏ ｉ ｙ ｅ２ Ｐ Ｖ一） ｎ ｒ ｕ 当前 影 响 养 猪 业 发 展 的 ３种 重 要 的 病 原【 。 由 于 １ ］ Ｐ Ｖ、 Ｒ Ｐ Ｖ ２单 独 感 染 或 混 合 感 染 均 能 引起 Ｐ Ｐ Ｖ、 Ｃ 一 猪发病 ， 造成 母 猪 的 繁 殖 障 碍／ 染 猪 的 免疫 抑 制 ， 感 为其他 病原 的继 发 感染 提 供 了便 利 ， 至会 造成 猪 甚 群 中疫病 的流 行 ， 养殖 生 产蒙 受损 失 ， 使 并有 可 能 引 发 公 共 卫 生 问 题［ 。Ｐ Ｖ 和 Ｐ Ｖ 是 造 成 猪 繁 殖／ ２ ］ Ｐ Ｒ
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用猪的生产健康一直备受关注，猪病的诊断和防治是保障猪群生产健康的重要环节。
近年来，PCR技术在猪病诊断和防治中的应用越来越广泛，得到了业界的高度关注。
本文将探讨PCR技术在猪病诊断和防治中的应用，以期为猪农和养猪企业提供一些有益的参考。
1. PCR技术原理PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA复制技术。
它通过特定的引物（即PCR 扩增引物）和酶的作用，把DNA片段进行多轮放大，从而使少量的DNA样本被扩增到可以检测或分析的水平。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点，广泛应用于分子生物学、生物医学、遗传学等领域。
2. PCR技术在猪病诊断中的优势(1) 高灵敏度：PCR技术对病原体的检测灵敏度非常高，可以检测到病原体的极低浓度，有利于早期诊断和防治。
(2) 高特异性：PCR技术可以通过设计特异性引物来识别目标病原体，避免了其他对猪群健康不构成威胁的微生物的干扰，确保诊断结果的准确性。
(3) 快速：PCR技术不需要培养病原体，可以在短时间内完成检测，有利于及时采取措施，减少疫情传播。
(4) 多重检测：PCR技术可以同时检测多种病原体，有助于全面了解猪群的健康状况。
目前，PCR技术已广泛应用于猪病的诊断，主要包括猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒、猪链球菌、猪传染性胃肠炎病毒等。
以猪瘟为例，PCR技术可以在短时间内检测到猪瘟病毒的存在，快速、准确地进行猪瘟的诊断，有助于及时隔离和治疗，避免疫情的蔓延。
除了在猪病的诊断中的应用外，PCR技术还可以在猪病防治中发挥重要作用，主要体现在以下几个方面：(1) 疫苗研发：PCR技术可以对病原体进行基因组序列分析，为疫苗的研发提供基础数据，有助于研发更安全、更有效的疫苗。
(2) 病原体监测：PCR技术可以在疫苗接种后对病原体进行监测，了解疫苗接种的效果，有助于疫苗的改进和优化。
(3) 病原体溯源：当猪群出现疫情时，PCR技术可以对病原体进行溯源，了解疫情的起源和传播途径，有助于采取针对性的防控措施。
猪常见病PCR检测程序
猪病检测手册目录猪瘟RT-PCR检测程序 (3)猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 (5)高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 (7)猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序 (9)猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序 (11)猪细小病毒（PPV）PCR检测程序 (13)猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）PCR检测程序 (15)细菌学检测程序 (17)猪瘟RT-PCR检测程序一、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。
方法将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1ml RNase-free管分装，每管500µl，-20℃保存。
取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。
RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50µl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。
2、疑似病料RNA的提取样品采集采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。
附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。
对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。
对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。
胎儿的保存方法同上。
组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（PH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA 的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。
RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50µl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。
二、R T-PCR反应1、材料RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。
猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用
4542023猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法R T-PC R检测方法的建立及应用陈雷兆丰华生物科技(福州)有限公司福州350014摘要为解决当前猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株类型复杂、各毒株之间交叉免疫保护不佳的现状,本研究针对N SP2基因保守区域设计1对特异性引物,通过条件优化,建立一种能够快速区分经典株、高致病性毒株和N A D C30-l i ke毒株的检测方法。
该方法与C SFV、PC V2、PR V、PED V、T G EV无交叉反应。
对不同毒株类型进行检测,结果显示该方法特异性强,能够将经典株、高致病性猪蓝耳病毒株和类N A D C30株进行快速区分,为猪群快速区分PR R SV感染类型及疫苗的选择、使用提供科学防控依据。
关键词猪繁殖与呼吸综合征经典毒株高致病性毒株N A D C30-l i ke毒株文献标识码:A文章编号:1003-4331(2023)04-0027-04D evel opm ent and appl i cat i on of one st ep R T-PC R m et hod f or t he det ct i onof porci ne reproduct i ve and res pi rat ory s yndrom e vi rusChen Lei(J of unhwa Bi ot echnol ogy(Fuz hou)Co.Lt d,Fuz hou350014)A bs t ract I n or der t o di s t i nct i on t he com pl ex t ypes of por ci ne r epr oduct i ve and r espi r at or y s yndr om e vi r us(PR R SV)s t r ai ns and t he poor cr os s-i m m une pr ot ect i on am ong t he s t r ai ns,a m et hod was es t abl i s hed t o di st i ngui s h di f f er entt ypes ofPR R SV,i ncl udi ng t he cl as⁃si calst r ai n,t he hi ghl y pat hogeni c s t r ai n and t he N A D C30-l i ke st r ai n by t he condi t i on of opt i m i z at i on.The r es ul t i ndi cat ed t hat i t has no cr os s r eact i on wi t h CSFV,PCV2,PR V,PED V and TG EV.A nd t he det ect i on of di f f er ent t ypes of vi r us s t r ai ns showed t hat t he m et hod was s peci f i c and coul d di st i ngui s h t he t hr ee t ypes of vi r us st r ai ns qui ckl y,t hat's pr ovi des a r api d di scr i m i nat i on and s el ect i on bas i s ofPR R S vacci nes f or pr event i on and cont r olofepi dem i c di seas es.K ey w ords Por ci ne r epr oduct i ve and r es pi r at or y syndr om e Cl ass i cals t r ai n H i ghl y pat hogeni c st r ai n N A D C30-l i ke st r ai n猪繁殖与呼吸综合征(Pr oci ne r epr oduct i ve andr es pi r at or y s yndr om e,PR R S)主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PR R SV)Ⅰ型和Ⅱ型引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的传染病[1]。
PCR 技术在猪病诊断和防治中的应用
摘要：PCR 技术又被称为聚合酶链式反应，其是一种重要的分子生物技术。
该技术的主要优点是能够将微量的DNA 大幅度增加，提高检测的精准度。
随着该技术的成熟，其不断的应用于重大疫病的科研和诊断中。
PCR 技术在猪病诊断和防治中的应用随着生猪养殖业的规模化和集约化发展，猪病的种类越来越多，严重影响我国生猪养殖业的健康发展，为此，应该采取科学的猪病诊断技术，从而为防治工作提供依据，PCR 技术的出现解决了猪病快速诊断的方法，本文主要阐述了PCR 技术在猪病诊断和防治中的应用。
01PCR 检测技术的发展经过多年的科研，PCR 技术应用于猪病的检测和诊断中，具有特异性高和便于操作等特点，得到了广泛的临床应用。
该技术能够在比较短的时间内使基因进行快速的扩增，从而使微量的基因检测在临床中得到应用实践。
现阶段，随着该技术的不断发展，其不仅仅局限于传统的检测技术，同时经过研究之后还出现了各种新型的PCR 技术。
02PCR 技术的优点在该技术实际应用的过程中，其优点主要包括以下几方面。
首先，操作性较强，技术能够简单的应用于实际的工作中。
其次，高效的扩增结果，能够实现成果的转化。
最后，特异性较高，技术性较强。
现阶段，该技术能够在很短的时间内实现快速扩张的形势使微量基因得到快速的检测。
02PCR 技术在猪病诊断和防治中的实际应用单一型病毒首先，猪2 型圆环病毒。
猪2 型圆环病毒的主要特点是形态小，是现阶段生物学范围内已知的最小形态的病毒。
相关的研究显示，此病毒包括PCV1 和PCV2 两个血清型。
前者属于非致病性的病毒，后者属于致病性病毒。
现阶段，猪2 型圆环病毒主要危害断奶仔猪，会使仔猪出现多系统衰竭综合征，死亡率可以达到10%，耐过猪的生长发育将变的迟缓。
采取疫苗免疫的方式能够提高猪只的抵抗力，减少疾病的发生。
通过一定的形式将该病毒基因作为模板，在适合的反应条件下建立起能够用于检测猪圆环2 型病毒的PCR 方法，相关的实验结果表明，该方法的特异性强，能够提高样品检测的灵敏度。
猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用
ｔｅｐｏｕ ｔ ａ ７ ｐ Ｔ ｅＳ Ｖ ｓ ａｎｉ ｌ ｅ ｒｍ Ｊ ｎｘ Ｐｏｉｃ （ ＷＰ ｈ ｒｄ ｃ ｗ ｓ ５ｂ ． ｈ ＷＰ ｔ ｉ ｓ ａ ｄｆ ｉ ｇｉ ｒ ｎｅ Ｓ Ｖ—Ｊ ０ ）ｗ ｓｔ ｅ ｓｔ ９ ｒ ｏ ｔ ｏ ａ ｖ Ｘ １ ａ ａ ｎａ ｅ ｋ ｍ．
Ａｂｔａ ｔＡ ｄｔ ｔ ｎｍ ｔｏ ｒ ｗｎ ｐ ｘＶｒｓ Ｓ Ｖ）ｗｔ Ｐ Ｒ ｔ ｈ ｉｕ ａ ｓ ｂｉ ｅ ｓ ｌ － ｓｒｃ ： ｅ ｃｉ ｅ ｄｆ ｉｅｏ ｉ （ ＷＰ ｅ ｏ ｈ ｏＳ ｕ ｉ Ｃ ｃ ｎｑ ｅｗ ｓ ｔ ｌｈ ｄａ ｒ ｉ ｈ ｅ ｅａ ｓ ａ ｅａ
ｐ ａｅ ．Ｔｈ ＣＲ ｅｅ ｔｏ ｔ ｏ ｒ Ｓ Ｐ ｗａ ｎ ｌ ｓａ ｌｓ ｅ ｎｄ ｒ ｏ ｔｍａ ｅ ｃｉ ｎ ｃ ｎ ｉｉｎ ． Ｔ ｅ ｌｔ ｓ ｅＰ ｄ ｔｃ ｉｎ ｍｅｈ ｄ ｆ Ｗ Ｖ ｓ ｆ ａ ｌ ｅ ｔｂ ｉｈ ｄ ｕ ｅ ｐ ｉ ｌｒ ａ ｔｏ ｏ ｄ ｔｏ ｓ ｈ ｏ ｉ ｙ ｔｓｓｆ ｒｔ ｅ ｓ ｅ ｉ ｃｔ ｅ ｔ ｈ ｐ ｃｆ ｉ ｏ ｉ ｙ，ｓ ｎ ｉｉｉ ｎ ｅ ａ ａ ｉｉ ｆｔ ｅ ＰＣＲ ｓａ ｒ ｏ ｄ ｔｄ，ｔ ｅ ｒ ｓ ｌｓ ｉ ｄ ｃ ｔ ｄ ｅ ｓｔ ｔ ａ ｄ ｒ ｐｅ ｔｂ ｌｔ ｏ ｈ ｖｙ ｙ ａ ｓ ｙ ｗｅ ｅ ｃ ｎ ｕｃｅ ｈ ｅ ｕ ｔ ｎ ｉａ ｅ ｔ ａ ｌ ｗｅ ｅ ｎｅ ａｉｅ ｔ ｈ ｐ ｉ ｌ ｅ ａ ｎ ｔ ｎ ｍｅｈ ｄ ｏ ｔ ｒ ｐ ｇ ｖ ｒ ｓ ｓ ａ ｄ ｔｅ ｎ ｃ ｓ ａ ｙ ｄ ｓ ｆｔｒ — ｈ ｔａｌ ｒ ｇ ｔｖ ｏ ｔ ｅ ｏ ｔｍａ ｘ ｍｉ ａ ｉ ｔ ｏ ｎ ｏｈｅ ｉ ｉ ｅ ｎ ｈ ｅ ｅ ｓ ｒ ｏ ｅ ｏ ｅ ｏ ｕ ｎ
猪 痘 病 毒 Ｐ Ｒ 检 测 方法 的建 立 及 应 用 Ｃ
PCR作为猪的诊断工具：1、基础知识
PCR作为猪的诊断工具：1、基础知识使用PCR检测(聚合酶链反应）是当今养猪生产医学中最常用的诊断工具之一。
它不仅用于诊断，而且还用作通过监测疾病、监测改善生物安全的手段。
因此，在解释结果时，了解此类技术的优缺点至关重要。
同样重要的是，相同的技术用于不同的病原体，结果方面会存在差异。
一、检测原理PCR检测用于检测细菌或病毒的遗传物质（DNA或RNA）。
该过程从从样品中提取DNA或RNA开始，然后通过扩增循环。
如果靶物质是RNA，第一步将是将RNA转化为DNA（技术上称为cDNA）。
热循环旨在创建1变性、2退火、3延伸的3步过程，这导致样品中存在的DNA的复制。
因此，对于每个周期（1 Ct），假设效率为100%，则存在两倍于DNA的存在。
然后，目标是继续扩增过程，直到检测到足够的DNA以使样品检测呈阳性或长达30-40个周期，具体取决于所用特定测定的设计。
PCR的机理示意图。
二、提取检测对象提取过程是PCR测定的关键步骤，因为它会影响测试样品中遗传物质的数量和质量。
对检测的样品类型（血清、口腔液、组织等）使用适当的提取过程至关重要。
扩增过程（退火过程）的步骤2需要使用引物，这些引物是DNA序列的短片段，专门设计用于仅附着并帮助复制所关注的靶向病原体的特定基因序列。
对于在基因上不断变异的病原体（例如PRRS病毒），必须定期更新这些引物以确保仍然检测到新毒株。
三、结果读取确定检测周期截止点（通常在30-40左右），是因为认识到如果扩增过程继续，最终由于自发退火和延伸，测定将变得阳性。
这表明，在解释结果时，尤其是在疫情结束时，需要特别考虑弱阳性结果、接近临界值的高Ct值。
在猪医学中有两种不同的PCR测定方法。
传统的基于凝胶的PCR 和更现代的实时荧光定量PCR。
两种测定的工作原理相同，都依赖于DNA或RNA的扩增。
不同之处在于，基于凝胶的测定仅在测定结束时“读取”一次，而使用实时PCR，测定结果在每个循环后被“读取”。
猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用
猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用文章标题：猪附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用在农业领域，猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用备受关注。
本文将从建立方法的过程、应用范围和未来发展等方面进行深入探讨，帮助读者全面了解这一重要的技术。
一、建立方法的过程1.1 猪附红细胞体PCR检测方法的原理猪附红细胞体PCR检测方法是一种基于多重PCR的检测技术，主要用于检测猪体内的特定病原体。
1.2 关键步骤和技术要点建立这一检测方法需要充分理解猪体内病原体的生物学特征，同时需要在PCR技术上进行优化，确保灵敏度和特异性。
1.3 方法的验证和实验数据经过大量实验和数据对比，可以确定该方法在猪体内病原体检测方面具有可靠性和准确性。
二、初步应用2.1 在疾病防控中的应用猪附红细胞体PCR检测方法可以用于疾病的早期诊断和监测，为疾病的控制和防治提供重要支持。
2.2 在饲养管理中的作用通过该方法的应用，可以及时检测病原体，避免疾病的传播，保障猪的生长和健康。
2.3 对农业生产的意义猪附红细胞体PCR检测方法的建立和应用，对农业生产具有重要意义，可以提高疾病检测的精准度，保障畜禽健康生产。
三、未来展望3.1 技术的改进和完善在未来，需要不断改进和完善猪附红细胞体PCR检测方法，提高其在现实应用中的效率和稳定性。
3.2 拓展应用领域除了用于猪体内病原体的检测，该技术还可以在其他动物的病原体检测中得到拓展，具有广阔的应用前景。
3.3 国内外研究现状与竞争优势通过了解国内外研究现状，可以为我们提供更多的启发和借鉴，提高我们的研究水平和竞争力。
个人观点和总结通过对猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用的深入探讨，我认为这一技术具有巨大的潜力和应用前景。
在未来，随着技术的不断改进和完善，相信它将在农业生产和疾病防控领域发挥更大的作用。
在撰写本文的过程中，我深刻理解了猪附红细胞体PCR检测方法的重要性和价值所在。
多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用
多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用在养殖业中，猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型等疾病给猪群的健康和生产带来了巨大的威胁，为了准确、快速地检测这些病毒的存在，我们建立了一种多重PCR方法，以提高检测的准确性和可靠性，并在实际应用中取得了良好的效果。
首先，我们从猪的血样和体液中提取病毒RNA或DNA，并对其进行适当的纯化。
然后，根据不同病毒的特异性序列，设计了相应的引物对。
针对猪伪狂犬病毒，我们选择了狂犬病毒基因组的保守区域；对于细小病毒，我们选择了VP2基因；对于猪圆环病毒2型，我们选择了VP1基因。
接下来，我们对所设计的引物进行了验证，确保引物能够特异性地扩增目标基因片段。
在PCR试验中，我们选择了适当的PCR条件并进行了优化。
优化包括调整引物的浓度、模板DNA的浓度、Mg2+的浓度以及PCR反应体系的总体积等，以提高PCR的特异性和灵敏性。
同时，我们还确认了扩增产物的大小和序列，以确保扩增的目标基因片段与预期一致。
为了验证我们设计的多重PCR方法的可靠性和稳定性，我们收集了不同来源和不同病理状态的猪样本，并进行了大量的PCR检测。
结果表明，我们的多重PCR方法能够准确、快速地同时检测到猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型的存在。
值得一提的是，在大多数猪群中，这三种病毒的感染常常同时发生，因此能够一次性检测多个病原体能够大大提高检测的效率和准确性。
除了在实验室中进行的验证，我们还将所建立的多重PCR方法应用到实际的猪群检测中。
我们在不同地区的猪场进行了现场应用试验，并与传统单一PCR方法进行了对比。
结果显示，多重PCR方法能够更快速、更准确地检测到猪群的病原体感染情况，为猪产业的保健和生产提供了有力的支持。
综上所述，我们成功地建立了一种多重PCR方法，用于同时检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型。
此方法在实验室验证和实际应用中都取得了良好的效果。
多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用的开题报告
多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用的开题报告一、选题背景及意义猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型是目前世界上广泛存在的三种重要的猪病毒。
其中，猪伪狂犬和细小病毒常常与猪瘟、猪流感等疾病联合发生，给猪养殖业带来了严重的经济损失。
猪圆环病毒2型也是近年来引起国内外猪圈疾病暴发的重要病原体。
因此，建立一种快速、准确、可靠的检测方法对于及时发现并控制猪病毒病害具有非常重要的意义。
二、研究内容及目标本研究旨在建立一种同时检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型的多重PCR 方法，并对该方法进行优化和应用。
具体包括以下内容：1.设计并合成特异性引物，建立同时检测三种病毒的多重PCR方法。
2.优化PCR反应体系和反应条件，探究最佳反应条件，降低假阳性结果的出现。
3.对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性检验，评价其检测效能。
4.应用该多重PCR方法对临床样本和环境样本进行检测，评价其在实际应用中的可行性。
三、研究方法1.特异引物的设计和合成：通过互补序列比对，利用在线软件设计猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型的特异性引物，合成对应引物。
2.采集相关样本：包括临床样本和环境样本，如猪血清、病灶组织、病毒液、猪场环境样品等。
3.多重PCR反应体系：建立同时检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型的PCR反应体系，包括引物、模板DNA、PCR反应缓冲液、酶等。
4.PCR条件优化：考虑到引物的特异性和反应体系的复杂性，需要对PCR反应条件进行优化，包括反应时间、温度、循环次数等。
5.PCR产物检测：通过PCR产物的凝胶电泳等方法进行PCR产物检测，检测并确定所检测样品是否具有三种病毒的存在。
四、预期结果及意义通过本研究，可以建立一种同时检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型的多重PCR方法，并对其进行优化和应用，在病毒病害防控方面具有重要的应用价值。
本研究可以为猪病毒病害的及时检测提供技术支持和理论指导，为保障和提高猪养殖业的健康发展做出积极的贡献。
常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制(精)
常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒(蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。
1、病料的处理取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。
2、RNA的提取1取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。
2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g 离心15 min。
离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动静置10分钟,4℃12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振摇,将白色沉淀悬浮,4℃7500g离心5 min。
弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20μLDEPC 水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。
两步法:1、反转录在10μL的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、0.5μL或者下游引物0.5μL;65℃10分钟, 10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV 100U/μL 0.25μL(反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。
2、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。
反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。
猪细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立
猪细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立崔宇超;彭永刚;马兴杰;崔尚金【摘要】为建立快速、灵敏的猪细小病毒(PPV)的检测方法,本研究针对PPV VP2基因的保守区域设计一对扩增472 bp片段的特异性引物,建立了PPV纳米PCR检测方法.敏感性试验表明纳米PCR方法是普通PCR的1 000倍,最低核酸检出量为4拷贝/μL.利用该纳米PCR方法检测猪的其他相关病毒核酸,结果均呈阴性.分别采用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品进行检测,PPV阳性率分别为95％(41/43)和72％(31/41),表明该纳米PCR检测方法具有更高的敏感性,适用于PPV低含量临床样品的检测.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2014(036)004【总页数】3页(P286-288)【关键词】猪细小病毒;VP2基因;纳米PCR【作者】崔宇超;彭永刚;马兴杰;崔尚金【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，临床症状以死胎和母猪流产为主要特征[1]。
目前，PCR是检测PPV的一种主要技术。
此外还有环介导等温扩增法(LAMP)[2]和荧光定量PCR方法[3-4]。
这些方法均是为了提高现有PCR的敏感性，但荧光定量PCR需要昂贵的定量PCR仪，LAMP容易形成气溶胶污染，这些缺点限制了其在临床中的简便应用。
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用1. 大宗猪病的PCR诊断大宗猪病包括猪传染性胸膜肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、猪病毒性腹泻等。
传统的病毒分离与鉴定技术需要大量时间和人力成本，而PCR技术具有快速、灵敏和特异的特点，能够对病毒进行高效、快速的检测和鉴定。
PCR技术在大宗猪病的诊断中有着广泛的应用前景。
除了大宗猪病外，个体猪病的诊断也是养殖业中的重要问题。
猪瘤胃溃疡、猪传染性胃肠炎等病害，常常需要针对个体猪进行病原检测。
PCR技术能够通过分子生物学方法快速、准确地检测出病原体，为个体猪病的诊断提供了有力的技术支持。
二、PCR技术在猪病防治中的应用疫苗是猪病防治的重要手段，而PCR技术在疫苗研发中发挥着重要作用。
通过PCR技术可以对病原体进行快速、准确的检测和鉴定，为疫苗株的选择和研发提供了重要的技术支持。
PCR技术还可以用于评估疫苗的效果，检测疫苗的抗原性和免疫原性，为猪病疫苗的研发提供了重要的技术手段。
除了疫苗研发外，PCR技术还可以在猪病的预防中发挥重要作用。
通过对猪场环境、饲料、水源等进行PCR检测，可以及时检测出潜在的病原体，做到早期预警和隔离，有效防止猪病的传播。
PCR技术还可以监测猪群的免疫水平，指导疫苗接种计划，提高猪群的免疫力，降低猪病的发生率。
1. 优势(1) 高度敏感性和特异性：PCR技术能够对极少量的目标DNA进行检测和扩增，具有较高的敏感性和特异性。
(2) 快速性：PCR技术可以在几小时内完成病原体的检测和鉴定，相比传统的病原分离与鉴定技术更快捷高效。
(3) 高通量：PCR技术可以对多个样品同时进行检测，提高检测效率和成本效益。
2. 局限性(1) 样品处理复杂：PCR技术对样品的处理和提取要求较高，容易受到外部因素的干扰。
(2) 容易产生假阳性：PCR技术在样品提取、试剂配制和扩增过程中易受到污染，容易产生假阳性结果。
(3) 高成本：PCR技术在设备、试剂和人力成本上相对较高，需要较为专业的技术人员进行操作。
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用PCR技术（聚合酶链反应）是一种在生物医学领域广泛应用的分子生物学技术。
其优势在于快速、灵敏、特异性高、操作简便等，因此在猪病诊断和防治中也得到了广泛应用。
在猪病诊断方面，PCR技术可用于快速检测猪体内病毒、细菌等有害生物的存在，可以通过对血液、粪便、尿液等样本的提取和PCR扩增，来检测病原体的核酸序列，进而得到病原体的存在情况和数量等信息，从而为病原体的防治提供依据。
如：1. 检测猪瘟病毒：PCR技术能够灵敏地检测猪瘟病毒的核酸序列，在猪瘟疫情爆发时可以快速有效地进行检测，有助于及时采取隔离、治疗等措施控制疫情。
2. 检测猪繁殖与呼吸综合症病毒：PCR技术能够快速检测到猪繁殖与呼吸综合症病毒的核酸序列，进行早期诊断，有利于预防疫情发生和传播。
3. 检测猪链球菌：PCR技术可以快速检测到猪链球菌的核酸序列，进一步诊断病情并针对性地采取防治措施。
1. 检测猪肠道菌群：PCR技术可检测出猪肠道中细菌的存在情况和数量，从而了解肠道微生物菌群组成以及对肠道健康的影响，为猪养殖提供科学依据。
2. 检测猪类常见疾病：PCR技术可用于检测猪体内的多种常见疾病，如豚鼠热、贫血病等。
对于豚鼠热这样的潜在人畜共患病，更是有着重要的预防作用。
在防治方面，PCR技术根据病原体检测成果，能够制定更为切实可行的防治方案。
1. 定向治疗：PCR技术检测到某种病原体存在后，可以针对性地选择有效的抗生素、抗病毒药物等进行治疗，避免不必要的药物使用，减少对环境和猪体健康的影响。
2. 预防控制：通过PCR技术检测，病原体存在时，根据情况选择接种疫苗、改变饲养和管理措施等方法，从根本上预防疫情的发生和传播。
总之，PCR技术在猪病诊断和防治中的应用是十分广泛和重要的。
通过PCR技术可以快速、精准地检测到病原体的存在情况，采取应对措施，并根据病原体检测结果选择最佳的防治方案，实现猪群的健康与生产的稳定。
PCR技术在猪病诊断和防治中的应用
现代畜牧科技 2018年第6期总第42期•69•doi:10.19369/ki.2095 —9737.2018.06.061P C R技术在猪病诊断和防治中的应用王金平，张会超(哈尔滨元亨生物药业有限公司，黑龙江哈尔滨150025)摘要：最近这些年以来，我国猪的饲养量比较大，但是由于饲养水平的不同，导致猪场中疾病的发生增多，而且流行 的疫病多为典型性、多种病毒混合感染的趋势发展，感染患猪在临床上表现的症状没有明显的特征性，从而导致对于疾病的确诊更加的困难。
现主要通过对于PCR技术特性的简单介绍，从PCR在临床生产中对于猪常见传染性疾病的诊断和防治方面展开分析，以期对疾病发挥更好的控制作用。
关键词：PCR技术；猪病；诊断（方治中图分类号：S858.28 文献标识码：B文章编号：2095 —9737(2018)06 —0069 —011 PC R检测技术的发展通过多年在临床应用PCR技术对于猪病的检测经验可知，该技术不仅扩增速度快，特异性高，而且最重要的优点就是便于操作，所以方便于临床应用。
PCR检测技术可以在比 较短的时间内针对目的基因展开比较快速的扩增，使得微量目的基因的检测在临床生产中得以实现，靶序列两端的寡核苷酸引物是决定PCR检测技术特异性的主要因素。
最近这 些年PCR检测技术呈现不断的发展状态，不仅是局限于传统的PCR检测技术，而是在此基础之上继续研究从而衍生出各种新型PCR技术。
2应用PC R技术检测单一病毒2.1 猪2型圆环病毒2—型圆环病毒（PCV)是目前所知的最小的动物病毒。
根据相关研究可知有PCV1和PCV2两个血清型，其中 PCV1属于非致病性的病毒而PCV2则是致病性的病毒。
临床中PCV主要会引发断奶仔猪多系统衰竭综合征，如果引 起的是急性发病，则患病猪群的病死率可能达到10%，而耐 过猪在生长的后期发育迟缓非常明显，生产中通常可以采用疫苗给猪群加以免疫，还有多种抗生素类药物也能对该病发挥一定的治疗效果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
江西农业大学学报2012，34（4）：781－785http：//xuebao．jxau．edu．cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E－mail：ndxb7775@sina．com猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用张文波，蒋新华，冷闯，邓舜洲*（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）摘要：建立猪痘病毒（swinepox virus，SWPV）的PCR检测方法，为SWPV的流行病学调查和临床诊断提供可靠技术支撑。
参考GenBank登录的SWPV（AF410153．1）基因组序列，设计合成1对引物，扩增目的片段为975bp。
以SWPV江西分离株SWPV－JX01为模板，对反应条件进行优化，建立了SWPV的PCR诊断方法。
特异性、敏感性和重复性试验表明，该方法对临床上常见的其它猪病毒检测结果均为阴性；对模板的最低检测量为2．7pg；具有良好的重复性。
用此方法检测50份疑似猪痘的临床样品，其中阳性率为80．2%。
该方法敏感度高，重复性和特异性良好，可用于猪痘病毒的分子流行病学调查和临床病例的诊断。
关键词：猪痘病毒；PCR；猪痘中图分类号：S852．65+9．1文献标志码：A文章编号：1000－2286（2012）04－0781－05Development and Application of a PCR Assayfor Detection of Swinepox VirusZHANG Wen-bo，JIANG Xin-hua，LENG Chuang，DENG Shun-zhou （College of Animal Science and Technology，JAU，Nanchang330045，China）Abstract：A detection method for Swinepox Virus（SWPV）with PCR technique was established as a relia-ble technological means for epidemiological investigation and clinical diagnosis of SWPV．A pair of primers were designed according to the genome of SWPV to develop a PCR assay for detection of SWPV，the length of the product was975bp．The SWPV strain isolated from Jiangxi Province（SWPV－JX01）was taken as tem-plates．The PCR detection method for SWPV was finally established under optimal reaction conditions．The tests for the specificity，sensitivity and repeatability of the PCR assay were conducted，the results indicated that all were negative to the optimal examination method on other pig viruses and the necessary dose of tem-plates of the assay was2．7pg．50clinical samples，which were suspected SWPV syndrome from Jiangxi Prov-ince，were analysed by the method，the result showed that80．2﹪samples（41/50）were SWPV positive．The PCR detection method established in this study has the characteristics of sensitivity，high specificity and good repeatability，may be used in molecular epidemiological investigation and rapid clinical diagnosis of SWPV．Key words：swinepox virus；PCR；swinepox猪痘病毒（swinepox virus，SWPV）在分类上属于脊椎动物痘病毒亚科猪痘病毒属唯一成员。
是引起猪痘（swinepox，SWP）的主要病原，以引起猪的发热、外表皮肤起水泡、形成痘疹和结痂为特征，对3月收稿日期：2012－05－01修回日期：2012－06－04基金项目：国家自然科学基金项目（31160498/C1803）作者简介：张文波（1972—），男，讲师，博士，主要从事动物传染病与免疫学研究，E－mail：hnzwb22@163．com；*通讯作者：邓舜洲，副教授，博士，E－mail：shzhdeng@163．com。
江西农业大学学报第34卷龄以内的仔猪危害较大，成年猪很少发生或症状轻微，可通过猪虱等叮咬机械传播，并与饲养卫生条件差有关［1］。
具有严格的宿主特异性，猪是该病毒的唯一感染宿主，1842年由Spinola 首次在欧洲发现并报道；2011年，Maria Luiza G 等报道SWP 在巴西爆发［2］，目前SWP 呈世界性分布。
SWPV 的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形，有囊膜，是最大型病毒，在水平方向大小约为320nm ˑ240nm 。
病毒粒子由一个中央双侧凹陷的核，两个横向的椭圆体和至少两层质膜组成［3］。
SWPV 的基因组约为146kb 的双股DNA ，含有150个阅读框（ORF ），A +T 含量为72．5%，和其它种属的痘病毒一样，包含一个139023bp 的保守中心基因编码区，该基因区域含有病毒复制和感染的必需基因，包括毒力、宿主范围和组织嗜性的有关基因［4］。
基因组的末端有2个反向末端重复序列（Identlcal inverted termlnal repeat ，ITR ），功能可能与调节或逃逸宿主的免疫应答、调节或抑制宿主细胞凋亡、细胞和组织嗜性等有关［5］。
我国已有猪群中发生猪痘的少量报道，但仅限于临床诊断或动物感染试验，均未见通过分子生物学手段从病原学角度确诊［6－8］。
本试验旨在利用PCR 反应对SWPV 基因进行扩增，建立一种快速、准确检测SWPV 的PCR 方法，以期为江西省SWPV 感染的分子流行病学调查及快速诊断提供技术支撑。
1材料与方法1．1材料1．1．1引物设计与合成根据GenBank 中登录（登录号：AF410153．1）的SWPV 基因组序列，设计1对引物。
引物序列如下：SP1：5'－CCGGAATTCATGACGACGCCTCAAAAAGAAATCG －3'。
SP2：5'－CCCTCGAGTTATACAATATACGTGAATCCTATTCC －3'，扩增片段大小为975bp 。
1．1．2SWPV 江西分离株（SWPV －JX01）本实验室分离鉴定。
1．1．3待检病料疑似猪痘病猪皮肤痘痂，采自江西省部分规模化猪场。
1．1．4主要试剂Taq DNA 聚合酶等均购自天根生化科技（北京）有限公司。
1．2方法1．2．1SWPV DNA 的提取以分离的毒株SWPV －JX01株接种PK15单层细胞，盲传3代，收集第3代细胞培养液600μL ，反复冻融3 4次；加入5μL 蛋白酶K 56ħ，消化2h ；再加入等体积的Tris 平衡酚，轻轻反复颠倒混匀10min ，室温12000r /min 离心10min ；吸取上清转移到新的离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25ʒ24ʒ1）重复上述抽提步骤；转移上清到新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24ʒ1）重复上述抽提步骤；向最后获得的上清液中加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA ，室温12000r /min 离心10min ，再用500μL 70%乙醇洗涤1次；轻轻弃去无水乙醇，自然风干2min ，加入50μL 灭菌的去离子水溶解。
用紫外分光光度计测量核酸的浓度，重复测量3次取平均值，－20ħ保存备用。
1．2．2PCR 以提取的基因组DNA 为模板，进行PCR 。
反应体系为50μL ，其中含10ˑEasyTaq Buffer 5μL ，5U /μL 的DNA 聚合酶0．5μL ，2．5mmol /L dNTPs 4μL ，20μmol /L 的上、下游引物各0．5μL ，模板2μL ，ddH 2037．5μL 。
扩增条件为：95ħ预变性5min ，95ħ变性45s ，54ħ复性1min ，72ħ延伸1min ，共30个循环；最后72ħ延伸8mim 。
1．2．3特异性试验按文献［9－10］方法提取猪痘病毒（SWPV －JX01）、伪狂犬病毒（PRV ）、圆环病毒（PCV ）、流行性乙型脑炎病毒（JEV ）阳性病料和正常PK15细胞的DNA ，猪瘟病毒（SFV ）、猪流行性腹泻病毒（PEDV ）和猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV ）阳性病料的RNA 。
以SP1/SP2为引物进行PCR或RT －PCR 。
1．2．4敏感性实验取SWPV 细胞培养液600μL ，提取病毒DNA ，用紫外分光光度法定量后，将DNA做10倍比稀释，每个稀释度取2μL DNA 稀释液作为模板，按1．2．2体系及方法进行PCR 扩增，验证本方法的敏感性。
1．2．5重复性实验以建立的PCR 对猪痘病毒（SWPV －JX01）进行重复性试验，重复检测3次，以验证PCR 方法的重复性。
·287·第4期张文波等：猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用1．2．6临床样品的检测从江西省各地区规模化猪场收集50份疑似猪痘病毒感染的病料（病猪背部和腹部外侧皮肤呈现数量不等、突出皮肤表面、直径0．5 2．0cm 的丘疹或结痂，采集其皮肤或结痂），加入灭菌生理盐水，匀浆器匀浆后12000r /min 离心10min 取上清，按1．2．1操作提取DNA 用作模板。
按1．2．2的方法进行PCR 检测。
2结果2．1PCR 检测方法的建立以纯化的猪痘病毒（SWPV －JX01）株DNA 为模板，SP1和SP2作为引物进行扩增，选择不同的退火温度做对比试验。
结果，在退火温度为54ħ时可扩增到1条大小约975bp 的条带（图1）。