朊病毒结构研究和致病机理分析

朊病毒结构研究和致病机理分析

摘要

朊病毒病是人和动物的一种退行性脑病，主要包括羊骚痒病，疯牛病，以及人的克雅氏综合症等。其致病因子被认为是一种由正常细胞PrP蛋白经非正常折叠所形成的蛋白质（PrPsc）。PrPsc和PrPc来自于同一基因具有相同的氨基酸序列，但在二级结构和三级结构上有很大的不同。科学界认为朊蛋白是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白

关键词：朊病毒PrPc PrPsc 重组朊蛋白高级结构

朊病毒（Prion Protein , PrP）是一种蛋白质亚病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒，

形态特征为小型蛋白质颗粒，大约有250个氨基酸组成，大小仅为最小病毒的1%。它是由动物机体中高度保守的朊病毒蛋白基因编码的蛋白质并能在机体的多种细胞中表达，在中枢神经系统及神经元细胞中表达量最高。朊病毒具有两种不同的分子构象：一种是存在于正常机体或感染动物的细胞中，没有致病作用，称为细胞朊蛋白（PrPc）,另一种是仅存在于感染动物的细胞中，称为朊病毒蛋白（PrPsc）。两种蛋白的一级结构完全相同，但二极结构及高级结构则有着显著差异。此种病毒可导致库鲁病（Ku-rmm）、克雅氏综合症（CJD）、格斯特曼综合症（GSS）、致死性家族失眠症（FFI）等常见人类疾病以及羊瘙痒病和疯牛病等动物

疾病[1]。朊病毒的传播途径包括：使用动物肉骨粉饲料、牛骨粉汤；医源性感染，如使用脑垂体生长激素、促性腺激素和硬脑膜移植、角膜移植、输血等。朊病毒特点是耐受蛋白酶的消化和常规消毒作用，由于它不含核酸，用常规的PCR技术还无法检测出来。

朊病毒的复制并非以核酸为模板，而是以蛋白质为模板。斯坦利由于发现PrPSC（一普里朊）和PrPC具有相同的一级结构而具有不同的二级和三级结构，打破了以往蛋白质的一级结构决定高级结构的定律，而获得了1997年诺贝尔生理学或医学奖[2]。

1982年普鲁宰纳提出了朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”，以后魏斯曼等人对其逐步完善。其要点为：

1、朊病毒蛋白有两种构象：正常型PrPc和致病型PrPsc，两者的主要区别在于其空间构想上的差异。PrPc仅存在α螺旋，而PrPsc有多个β折叠存在，后者溶解度低，且抗蛋白酶解；

2、PrPsc可胁迫PrPc转化为PrPsc，实现自我复制，并产生病理效应；

3、基因突变可导致细胞型PrPc中的α螺旋结构不稳定，至一定量是产生自发性转化，β片层增加，最终变为PrPsc型，并通过多米诺效应倍增致病[3]。

朊病毒的一级结构

PrP前体全长为253个（人）～264个（牛）氨基酸，分子质量为33～35KD。 PrP前体的N端的22个疏水氨基酸残基为信号肽序列。C端的23个（人为22个）疏水氨基酸残基是糖基磷酸肌醇结合位点（GPI）。这两部分将通过翻译后修饰水解除去，因此人的成熟PrP 仅为中间的第23位～第231位氨基酸共209个残基组成的序列。N端的23～95位氨基酸残基之间有一个富含组氨酸和甘氨酸的八肽重复区（PHGGGWGO）（51～91位氨基酸），第96～112位氨基酸序列是PrP的结构控制区，113～135位有一段跨膜区，135～231位之间是3个束状螺旋区域[4]。

成熟的PrP分子有两个N型糖基化位点，分别为第181位和第197位的两个天冬酰胺（Asn）残基，在第179位和第214位的两个半胱氨酸（Cys）残基之间有一个二硫键，第183位和

第192位的2个苏氨酸（Thr）磷酸化序列一致，第145位的酪氨酸（Tyr）被硫化，第155位的酪氨酸是其磷酸化位点之一（除灵长类及啮齿类动物之外），第147位～第163位的氨基酸之间有一芳烃回文序列。

此外PrP含有3组不同的短肽重复，第一组为6肽重复结构；第二组为8肽重复结构（PHGGGWGQ）（其中第一个重复是9肽：PQGGGGWGQ）；第三组是2个肽的串联重复，与前面所提到的芳烃回文序列部分重合，所有这些重复似乎为PrP独有[2]。

研究发现PrP序列中的糖基化位点，形成二硫键的Cys位点和疏水的跨膜区最为保守。其次为N端的信号肽水解位点，C端的糖基磷酸肌醇结合位点（GPI）和α螺旋结构区域的序列，八肽重复序列极为保守，均为P（H/Q）GGG（G/-）WGQ，但不同物种之间的重复拷贝数有所不同。PrP经过蛋白酶K水解后，其正常的PrPc被完全水解掉，而有侵染特性的PrPsc则被水解掉N端的67个氨基酸残基和C端的25个氨基酸，变为分子质量只有27～30KD的PrP27～30。据研究推测蛋白酶K的N端切点位于富含G的八肽重复区域，在89～90位点的G-W间的肽键断裂。这种具有抗蛋白酶K功能的PrP27-30（PrP-res）的出现被认为是朊蛋白病毒致病的关键[5]。一般认为PrPc三维结构形似“风筝”，其N端存在着缺乏有序结构的片段，这一结构片段高度柔顺，可以在溶液中随意摆动，犹如风筝的“尾巴”，在其C端则含有3个α螺旋，2个反向平行的β-折叠及一个二硫键，有多处被糖基化、磷酸化、硫基化等化学修饰的氨基酸位点，结构严密，形态固定，构成一个球状结构区域，是一个自折叠单位，整体看来形似风筝的头和躯干。

最近提出的BoPrP23-230NMR结构模型与HuPrP23-230NMR结构模型高度相似，也说明了朊蛋白病的代表—疯牛病从牛传染给人的可能[5]。

PrPsc及其经过蛋白酶水解后形成的PrP27～30极为难溶，以往的变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）等方法已不可能研究及预测出其较为准确的三维模型。因此在以上研究出的PrPc的结构模型基础上，人们试将其中的部分α螺旋改为β折叠，进而探索其新的PrPsc 结构模型。

PrPC→PrPSC

PrPSC在N端切割可以产生PrP27-30，这种分子是一种蛋白酶抗性蛋白，能够聚集成为棒状淀粉样蛋白。二级结构出现α螺旋→ β折叠转换，PrPC的α螺旋含量达到42%，β片层仅占3%；PrPSC的α螺旋含量降到30%，β片层达到45%；PrP27-30 α螺旋含量则仅为21%，而β片层达到54%。具有大量的β折叠的PrPsc溶解度会降低，抗蛋白酶水解能力会增强，在转变过程中，唯一的二硫键仍保持完好，主要转变部位在第90～112位的氨基酸残基之间[6]，β片层含量的增加可能是聚合成淀粉样原纤维的最直接原因。

Prusiner实验室的Wille最近提出了PrPsc的二维结晶结构模型。这种模型显示出跟以往不同的特点是α螺旋不是转变为β折叠，而是转变为β螺旋，整个二维结晶结构模型呈六边形结构，N端的β螺旋位于六角单元之内，与位于六角形边上的第二个螺旋和第三个螺旋及位于六角形单元之间的糖基相对称[7]。他的这个模型是通过电镜发现的，结晶结构只能在高分辨率的条件下被发现，光谱研究条件下β折叠和β螺旋是不能被区分的，所以这点差异在早期的研究中没有被发现。

朊病毒特殊的理化性质

1. 高压蒸汽灭菌（134℃～138℃）18分钟不能使其完全灭活。

2. 对紫外线（波长254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高40～200倍，但是对237nm的紫外线敏感。

3. 对一般的离子辐射和超声波抵抗力很强。