水稻农杆菌转化方法
农杆菌的转化流程
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农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板,26-28℃培养48 h;②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中,250 r/min,26-28℃悬浮培养12—16 h;③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中,4℃,8000 r/min,离心8 min;④弃上清,加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌;⑤4℃,8000 r/min,离心8 min;⑥弃上清,加入原始菌液1/50体积(800μl/管(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)并分装成100μl)的20 mM CaCl2重悬菌体;⑦置液氮中10 s,放入-20℃冰箱中保存备用。
2.农杆菌的转化(冻融法)将感受态农杆菌置于冰上,加入1μg质粒DNA(体积不宜超过10 μ l),充分混匀,冰上放置30 min;②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中,待其融化;③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃,230 r/min 培养2-4 h;(或直接用1 mlμl,留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板);⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h;⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中,28℃,250 r/min 培养48 h,将菌液用于保存或转化;注:EHA105抗利福平霉素,LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素,以防止杂菌污染。
以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。
3.转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养:① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后,用无菌水清洗两次,更换NaClO处理25—30 min,无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基(大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。
农杆菌转化法详细过程
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农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段:根据需要,挑选合适的质粒载体,通常是常用的pUC18或pUC19,然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位;
2、PCR扩增:使用上述质粒模板进行PCR扩增,以获得清洁的受体片段;
3、克隆:把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中,然后克隆到载体存储库中,以创建定向载体用于后续研究。
二、原核转化
1、准备转化粒菌:在装满氯化物的快速离心管中,将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液;
2、增加plasmid 质粒:在用有抗生素控制的细菌方法中,增加转换用材料,如plasmid质粒,磷酸二钙和CaC1₂,以及可能的其他试剂;
3、原核转化:将上述的悬浮液(AP出水液)添加到悬淋液中,然后加入CaC1₂和磷酸二钙,用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟;
4、选择转化的细胞:将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中,然后将这些细胞培养到辅助抗生素中,以选择转化的细胞,在抗生素抑制剂中,该细胞会死亡;
5、筛选和鉴定:原核基因转换后,体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株,最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体,以确定该菌株具有最终突变基因。
水稻转化方法
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水稻转化方法1.愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子,用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰,保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min,再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液,并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上,消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上,洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分,再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃,持续光照(100 mole m-2 s-1)。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2.农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10,选取阳性菌株,再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中,于28 ℃暗培养3天。
3天后,用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中,以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是,农杆菌应充分分散,而且浓度不能太大(OD600=0.1),否则后续的脱菌效果不好。
3.愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织(长出的水稻芽与种子去掉)浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中(在加入愈伤前,先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L),摇动5min。
同时,在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸,用1 mL 的AAM浸染培养基打湿,并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干,置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4.农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中,先用无菌水洗涤4-5次,直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量,于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液,继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次,再加入适量羧苄青霉素溶液,于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min,然后倒掉洗液,继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次,最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
农杆菌转化流程
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农杆菌转化流程农杆菌转化流程一、农杆菌转化前准备1、必需用到的实验资料(1)转录质子DNA:需要准备好转录质子DNA,一般是由特定的宿主表达稳定贮存的转录质子DNA,或从基因构建中可以获得。
(2)农杆菌载体:以合成DNA或者从宿主菌株中获得的农杆菌载体,其中可以放置表达构建,并且有足够的特殊的鉴定序列(如PCR、Restriction digest),可以鉴定它在农杆菌中的位置。
(3)其它实验质子:比如抗性菌株、生物毒素、和其它的必需的分子质子,也可以从宿主中获得。
2、建立农杆菌转化流程(1)根据转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的特性,建立转化流程,确定各项步骤的操作条件。
(2)根据实验室的条件,准备好相应于上述农杆菌转化流程的实验室基础设施,如冰箱、催化器及其他必须用到的实验用品。
3、准备农杆菌显微镜试剂准备好能够激活农杆菌的显微镜试剂,比如,酶共沉淀染色液,用于检测农杆菌的运动能力; UV诱导染色液,用于分析表达的转录质子pDNA在农杆菌中的分布情况;以及抗性染色液,用于分析表达的转录质子pDNA是否具有抗性。
二、农杆菌转化操作1、消毒操作消毒操作是农杆菌转化最重要的一步,需要准备好消毒设备,以及配备灭菌盘、戴手套等安全措施,严格按照安全操作步骤,进行消毒操作。
2、培养基及农杆菌培养将农杆菌放入合适的培养基中,细菌以合适的温度培养,直到细菌数量达到目标为止。
3、农杆菌转化根据预先设计好的步骤,进行农杆菌转化操作,以及对转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的配比等操作,最终完成农杆菌转化操作。
4、农杆菌筛选将转化后的农杆菌通过显微镜试剂以及其他实验方法进行筛选,确定转化的成功率和转录质子DNA的表达水平。
5、农杆菌转化文库构建将转化成功的农杆菌进行分离,收集多个样本进行文库构建,用于后期实验,或者进行其它实验。
农杆菌转化法原理
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农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术,其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化,使外源基因被导入植物细胞内,从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用,为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤:1. 农杆菌感染植物细胞。
首先,将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中,然后将农杆菌与植物组织接触,使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后,Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因,通过农杆菌的介导,成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内,它们会与植物细胞的染色体发生重组,将外源基因整合到植物基因组中。
这样,外源基因就成为植物细胞的一部分,可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中,它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状,比如抗病虫害、耐逆境等,从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰,通过这种方法可以实现对植物基因的改造,为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中,农杆菌转化法已经成功应用于多种作物,如水稻、小麦、玉米、大豆等,为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说,农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术,其原理清晰,操作简单,成功率高,因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善,相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌介导的水稻转化
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农杆菌介导的水稻转化一.愈伤组织的培养1.愈伤组织的诱导成熟水稻种子去壳,用70%酒精处理2min,无菌水冲洗2~3次,再用25%次氯酸钠消毒处理15min,无菌水冲洗5~6次,将种子转到灭菌的培养皿上,于超净工作台上吹干。
接种到诱导培养基N6AD2.5上,28℃暗培养至长出愈伤组织(10 d左右)。
2.继代培养用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上,28℃暗培养10 d。
继代培养两次后待用。
二.农杆菌的转化及培养1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化,并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中,加入2.5uL pHB质粒,冰浴30min,电击,向电击杯中加入800uL SOC 混匀,将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中,28℃,200rpm,振荡培养2h,13000rpm离心5min,去掉大部分上清液,用200uL枪头吹打悬浮,涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上,28℃培养至长出菌落。
2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中,200rpm振荡培养过夜,取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5,5000rpm离心5min收集细胞,用N6A CO液体培养基重悬。
三.浸染与共培养1.选择生长状态良好的愈伤组织,用无菌镊子将其适当夹小,创造伤口,然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡,一般浸染时间为10~30min,浸染时要不是摇动。
2.倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。
3.将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6A CO固体培养基上,26℃暗培养2~3天,直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
四.脱菌与筛选1.共培养的愈伤组织放在广口瓶中,用无菌水清洗至清澈;2.浸泡于含500mg/L Cef 的N6A CO液体培养基中,在摇床上中速振荡30~60min;3.弃液,将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上,26℃暗培养3周,再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。
农杆菌介导的水稻转化
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农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展,越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来,如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因,参与对病原物识别的基因等,要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位,就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物,来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体,由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛,不受寄主范围的限制,转化率较高,但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点:外源DNA的整合方式复杂,常常是多拷贝插入,较易出现转基因沉默现象,转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb),转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比,农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养,简便易行,能有效地转入较大的外源DNA片断;转化效率高,转化的外源基因整合位点比较稳定(一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合),整合的外源基因基本上保持其结构的完整性;整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝;整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高,共抑制现象相对较少;转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线,28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃,220rpm振荡培养至OD600=0.5。
农杆菌介导的转化方法知识分享
![农杆菌介导的转化方法知识分享](https://img.taocdn.com/s3/m/7a968e013d1ec5da50e2524de518964bcf84d2a5.png)
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中,诱导双子 叶冠瘿瘤形成,又称肿瘤诱导质粒(tumor inducing plasmivirD、virB…
第四步 T-DNA转移
T-DNA被vir基因产物切下来,并运送到植物细胞 核里,整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素,形成植物冠瘿瘤。
第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活体接种法
1.共培养法
The co-integration method
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染 愈伤组织 分化生芽 生根
3. 活 体 接 种 法
农杆菌转化实验步骤
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农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术,可以将外源DNA导入植物细胞。
下面是农杆菌转化实验的基本步骤:
1. 制备农杆菌:首先,选择适合的农杆菌株,常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。
接种农杆菌于适宜的培养基中,培养至合适的生长期。
2. 构建质粒:在进行转化实验前,需要构建包含目标基因的质粒。
质粒可以通过常规的分子生物学技术,如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。
3. 准备细菌:将构建好的质粒转化到农杆菌中。
通常采用电穿孔或热激方法,使质粒能够进入农杆菌内。
4. 感染植物:选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体,将其暴露在含有农杆菌的培养基中。
农杆菌会侵入植物细胞,并将质粒转移
到植物基因组中。
5. 抗生素筛选:转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。
将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中,该抗生素能够选择出已转化的细胞。
只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。
6. 再生植物:选定抗生素抗性的植物细胞,进一步培养和处理以促进其发育和增殖。
通过激素处理和适当的培养条件,可以使其分化成完整的植株。
7. 验证转化:最后,通过分子生物学技术,如PCR和Southern blot 分析,来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因,以及其在植物细胞中的表达。
农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法,可用于植物基因工程及改良研究。
通过以上步骤,可以成功将目标基因导入植物细胞中,以获得具有所需性状的转基因植物。
农杆菌转化
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农杆菌转化植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分:农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择:LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化:将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线(或加或不加抗生素,LBA4404:Rif 或Str;EHA105:Rif或Str;GV3103:庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失,导致农杆菌缺乏侵染性),抗生素浓度为:50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备:1)挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2)吸取1.5ml菌液于离心管中,冰浴10min;3)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;4)沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min;5)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;6)每管用100μl 20mMCaCl2悬浮,用于转化;制备好的感受态细胞可马上使用,也可按每管200ul分装于无菌离心管中,于4℃保存48小时内使用,长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出,置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌:1)50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1~1μg(5-10ul),之后冰浴30 min;2)放入液氮中5min(或1min),然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min;3)取出离心管,加入0.5mlLB,28℃、220rpm振荡培养3~5hr;4)取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板,在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)5、重组农杆菌鉴定:1)挑取单菌落,接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,28℃振荡培养过夜。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)2)小量提取质粒DNA,加GTE同时加5μL溶菌酶(50μg "ml -1,贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml)。
水稻(Oryzasativa)遗传转化实验技术原理
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水稻(Oryzasativa)遗传转化实验技术原理水稻是重要的谷类作物,世界上一半以上的人口以它为主食。
人们一直致力于水稻品质和产量的提高。
此外,水稻还是研究基因功能和调控机制的重要模式植物。
农杆菌介导的遗传转化由于转化效率高、T-DNA整合拷贝数少,因此目前是常用的水稻转化方法。
我们公司多种农杆菌介导的水稻转化方法,主要有以下几种:•共培养农杆菌与从成熟种子获得的愈伤组织(图1)。
•共培养农杆菌与不成熟的胚。
•在用液体培养基浸润过的滤纸上共培养水稻愈伤组织和农杆菌。
•共培养农杆菌与悬浮细胞。
该方法可以提供转化效率。
•将浸泡后的成熟种子的顶端胚性组织用针穿刺后与农杆菌共培养。
接种后的种子可不经过组织培养的过程直接长成植株然后结籽。
•原位蘸花法。
•组织培养和植物生长条件。
•多样的水稻品种: japonica品种: Nipponbare、 Zhonghua11、 Akdong、 Suweon330、Anjungbyeo、 Taipei309、 Cheniere和Katy;indica 品种:9311、 Minghui86、 Minghui63、Kasalath、ASD16、White Ponni、BR29和IR64。
•农杆菌菌株:GV3101、AGL-1、 EHA101、 EHA105和C58C1等。
•多种筛选标记:Kanamycin、Hygromycin、Phosphinothricin和G418等。
图 1. 农杆菌介导的indica水稻成熟种子诱导的愈伤组织转化(Sahoo and Tuteja, 2012)。
参考文献:•Sahoo R. K.; Tuteja N. (2012) Development of Agrobacterium-mediated transformation technology for mature seed-derived callus tissues of indica rice cultivar IR64, GM Crops and Food: Biotechnology in Agriculture and the Food Chain, 3 (2), 123-128.。
水稻遗传转化实验报告
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一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果,通过构建基因表达载体,将目的基因导入水稻细胞中,从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料:水稻品种为南桂占,农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105,目的基因(GFP基因)载体为pBI121。
2. 试剂:农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆:将GFP基因从质粒载体pBI121中切出,插入到农杆菌载体pBin19中,构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化:将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中,在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化:将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合,用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上,28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒:将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒,再用无菌水冲洗3次,然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染:将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上,用无菌滤纸轻轻擦拭叶片,使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导:将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中,28℃条件下培养5-7天,诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选:将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中,28℃条件下培养3-4周,筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生:将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中,28℃条件下培养2-3周,诱导再生植株。
9. 抗性鉴定:将再生植株种植于田间,对植株进行潮霉素筛选,筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测:对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测,验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆:成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化:农杆菌转化效率较高,大部分叶片出现愈伤组织。
农杆菌转化法的过程
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农杆菌转化法的过程农杆菌转化法(Agrobacterium-mediated transformation)是一种广泛应用于农业科学和生物技术研究的基因转化方法。
该方法利用一种土壤细菌,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将外源基因转移到植物细胞中。
农杆菌转化法具有转化效率高、适用广泛、转基因稳定等优点,已被广泛应用于农作物和果树的遗传改良、抗病抗虫育种等领域。
1.细胞培养首先,需要从植物中获得要进行基因转化的组织细胞(通常是幼苗的果荚或子叶)。
这些组织细胞被培养在含有植物生长激素的富营养培养基中,使其加速分裂和生长。
2.农杆菌培养将农杆菌菌株(通常是含有外源基因的农杆菌株)培养在液体培养基中。
培养基中含有特定的营养物质和抗生素,以促进菌株的生长和维持菌株稳定。
3.动态系统将培养好的植物细胞和农杆菌菌液混合,形成动态系统。
混合液中的植物组织和农杆菌菌株会发生暂时性的融合并进入植物细胞。
4.感染阶段通过共培养或注射等方式,使动态系统中的农杆菌菌株进入植物细胞。
农杆菌会通过特定的受体识别和感染植物细胞。
5.DNA传递一旦农杆菌菌株感染了植物细胞,它会将其含有外源基因的DNA片段传递给植物细胞。
这个DNA片段通常是携带目标基因和选择标记基因的载体。
选择标记基因可以使得转化后的植物细胞在包含选择抗生素的培养基上存活。
6.培养和筛选转化后的植物细胞被转移到含有选择抗生素的培养基中,使得只有携带外源基因的细胞可以生长和分裂。
这样就可以筛选出带有目标基因的转化植物细胞。
7.植株再生将筛选出的转化细胞培养到适当的大小和形态后,再将其转移到含有特定激素的培养基中,以促使其分化为整个植株。
经过适当的培养和生长,就可以获得转基因植物。
总结来说,农杆菌转化法通过将植物细胞和农杆菌菌株进行共培养,使农杆菌将外源基因传递到植物细胞中,然后通过筛选和培养,最终获得转基因植物。
这种方法在农业科学和生物技术研究中具有广泛的应用前景。
水稻转基因技术的研究与应用
![水稻转基因技术的研究与应用](https://img.taocdn.com/s3/m/1cea460366ec102de2bd960590c69ec3d5bbdbbc.png)
水稻转基因技术的研究与应用水稻是我国的主要粮食作物之一,也是全球最重要的粮食作物之一。
随着社会和经济的不断发展,人们对水稻品质和产量的要求也不断提高。
而转基因技术作为一种创新性技术,为水稻的改良提供了新的途径。
本篇文章将探讨水稻转基因技术的研究与应用。
一、水稻转基因技术的研究1.背景水稻转基因技术是将外源基因导入水稻细胞中,使水稻获得某些特定基因的性状。
这样可以通过调整水稻的生长和发育,使其在抗病、耐旱、提高产量等方面得到改善。
2.研究方法水稻转基因技术主要包括以下三种方法:(1) 农杆菌介导转化:将所需基因导入农杆菌载体,经过处理后将其导入水稻细胞中,使细胞产生抗病、提高产量等性状。
(2) 基因枪法转化:将所需基因载入金属小粒子上,压缩空气将粒子“射”入水稻细胞中。
(3) 电穿孔法转化:利用电场作用使水稻细胞短暂性开放,使基因能够有效导入细胞中。
3.研究进展目前,水稻转基因技术已取得了一些重要的进展,主要体现在以下几个方面:(1) 抗虫基因的成功导入:2007年,我国科学家成功将抗虫基因导入水稻,并以此培育了多个抗虫水稻品种。
(2) 抗病基因的成功导入:我国科学家通过细胞融合技术,将米瘟抗病基因导入一种水稻品种中,并获得了抵御米瘟病的水稻品种。
(3) 抗旱基因的成功导入:我国科学家成功将抗旱基因导入水稻,良种生长在干旱条件下的产量大大提高。
二、水稻转基因技术的应用1. 抗虫作物的生产目前,我国已经培育了多个抗虫作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交,产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐虫。
2. 抗病作物的生产目前,我国已经获得了多个抗病作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交,产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐病。
3. 提高产量基因工程水稻的生产方式与传统水稻生产方式相比,具有很大的优势。
通过导入相关基因,可以提高水稻的产量,并缩短生长周期。
4. 改善品质基因工程水稻的应用还可以改善水稻品质,如改良失酬水稻的品质和味道等。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
![植物表达载体转化农杆菌操作步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/fa890c2deefdc8d376ee32c1.png)
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源:郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分:农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择:LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化:将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线(或加或不加抗生素,LBA4404:Rif 或Str;EHA105:Rif或Str;GV3103:庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失,导致农杆菌缺乏侵染性),抗生素浓度为:50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备:1)挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2)吸取1.5ml菌液于离心管中,冰浴10min;3)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;4)沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min;5)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;6)每管用100μl 20mMCaCl2悬浮,用于转化;制备好的感受态细胞可马上使用,也可按每管200ul分装于无菌离心管中,于4℃保存48小时内使用,长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出,置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌:1)50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1~1μg(5-10ul),之后冰浴30 min;2)放入液氮中5min(或1min),然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min;3)取出离心管,加入0.5mlLB,28℃、220rpm振荡培养3~5hr;4)取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板,在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)5、重组农杆菌鉴定:1)挑取单菌落,接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,28℃振荡培养过夜。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)2)小量提取质粒DNA,加GTE同时加5μL溶菌酶(50μg "ml -1,贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml)。
农杆菌转化原理
![农杆菌转化原理](https://img.taocdn.com/s3/m/f1d443477dd184254b35eefdc8d376eeafaa175d.png)
农杆菌转化原理农杆菌转化原理是一种常用的基因转移技术,它可以将外源基因导入植物细胞中,从而实现基因的转移和表达。
农杆菌转化原理的核心在于利用农杆菌的特殊能力,将外源DNA导入植物细胞,从而实现基因的转移和表达。
首先,农杆菌转化原理的关键在于农杆菌的Ti质粒。
Ti质粒是农杆菌的一个重要遗传元素,它携带了一些特殊的基因,这些基因可以导致植物组织形成肿瘤。
利用这一特性,科学家将需要转移的外源基因插入到Ti质粒中,然后将农杆菌与植物组织接触,农杆菌就会将Ti质粒中的外源基因导入植物细胞中。
其次,农杆菌转化原理的过程可以分为几个关键步骤。
首先是感染阶段,农杆菌通过感染植物细胞,将Ti质粒中的外源基因导入植物细胞中。
然后是表达阶段,外源基因在植物细胞中得到表达,从而产生特定的蛋白质或表型。
最后是遗传稳定阶段,外源基因在植物细胞中得到遗传稳定,从而实现长期的表达和遗传。
农杆菌转化原理在植物基因工程中有着广泛的应用。
通过农杆菌转化原理,科学家可以将抗病、抗虫、耐逆等特定基因导入植物中,从而改良植物的性状,提高植物的产量和品质。
此外,农杆菌转化原理还可以用于研究植物基因的功能和调控机制,为植物遗传改良和育种提供重要的技术手段。
总的来说,农杆菌转化原理是一种重要的基因转移技术,它通过利用农杆菌的特殊能力,实现外源基因在植物细胞中的导入和表达。
农杆菌转化原理在植物基因工程和遗传改良中有着重要的应用前景,对于提高农作物的产量和品质,改良植物的抗逆能力,以及研究植物基因的功能和调控机制具有重要意义。
随着技术的不断进步,农杆菌转化原理将在农业生产和科学研究中发挥越来越重要的作用。
农杆菌介导转化方法
![农杆菌介导转化方法](https://img.taocdn.com/s3/m/0f1f9c7932687e21af45b307e87101f69e31fbde.png)
农杆菌介导转化方法农杆菌介导转化方法是一种常用的基因转化技术,广泛应用于植物、微生物等领域。
本文将介绍农杆菌介导转化方法的原理、步骤和应用。
一、原理农杆菌介导转化方法是利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)作为载体,将外源基因导入目标细胞中的一种方法。
农杆菌是一种自然界广泛存在的土壤细菌,它能将其自身的DNA转移到植物细胞中,从而导致植物发生病理性变化。
利用这一特性,科学家将目标基因插入到农杆菌的载体DNA中,通过农杆菌的感染作用,将目标基因导入到目标细胞中。
二、步骤农杆菌介导转化方法通常包括以下几个步骤:1. 农杆菌培养:首先需要将含有目标基因的农杆菌培养至适宜的生长期,以保证其感染能力。
2. 植物处理:将目标植物的组织经过表面消毒处理,然后将其切割成小片或小块,以增加接触面积。
3. 农杆菌感染:将培养好的农杆菌与植物组织接触,使其感染植物细胞。
通常使用浸泡法或注射法进行感染。
4. 抗生素筛选:在感染后的组织中加入适当浓度的抗生素,以筛选转化成功的细胞。
只有携带目标基因的细胞才能够存活下来。
5. 培养和再生:将筛选出的转化细胞进行培养和再生,形成转基因植株。
三、应用农杆菌介导转化方法已成功应用于多种植物和微生物中,具有以下几个优点:1. 高效性:农杆菌介导转化方法可以在较短时间内实现大量基因转化,且转化效率较高。
2. 转基因稳定性:通过农杆菌介导转化方法获得的转基因植株通常具有较高的遗传稳定性,能够稳定地传递给下一代。
3. 广泛适用性:农杆菌介导转化方法适用于多种植物和微生物,包括农作物、果树、花卉等。
可以用于改良作物的品种、抗病性、耐逆性等性状。
4. 无需种子:与传统的植物遗传改良方法相比,农杆菌介导转化方法无需使用种子,能够直接利用植物的组织进行转化,节约了时间和资源。
5. 无需外界辅助:农杆菌介导转化方法不需要借助特殊设备或昂贵试剂,只需在实验室条件下进行即可。
农杆菌介导的水稻转化全过程
![农杆菌介导的水稻转化全过程](https://img.taocdn.com/s3/m/b8c40e1c650e52ea55189882.png)
农杆菌介导的水稻转化全过程[1、基本培养基为NB培养基(NB培养基配方见附录1),愈伤诱导、转化及分化培养基如下:1、诱导培养基:NB+2,4-D 2 mg·L-1;PH =5.8-6.02、共培养培养基:NB+2,4-D 2 mg·L-1 +AS 100 uM·L-1;PH =5.83、预培养培养基:NB+2,4-D 2 mg.L-1;pH =5.8-6.04、选择培养基一:NB+2,4-D 2 mg·L-1 +羧卞青霉素250 mg·L-1+ Hyg 30mg·L-1;PH =5.8-6.05、选择培养基二:NB+2,4-D 2 mg·L-1 + Hyg 50 mg·L-1;PH =5.8-6.06、恢复培养基:NB+2,4-D 2 mg·L-1 +羧卞青霉素250 mg·L-1 PH =5.8-6.07、分化培养基:NB+KT 10 mg·L-1+ NAA 0.4 mg·L-1;PH =5.8-6.08、生根培养基:1/2MS无机盐+MS有机成分+Hyg 30 mg·L-1;PH =5.8-6.02、胚性愈伤组织的诱导及继代取水稻授粉后15-20d的未成熟穗,将未成熟种子剥壳后75%乙醇浸泡1min,再转入20%的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min,于超净工作台中无菌水冲洗三次,将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导培养基中,每皿约20粒,于27℃中暗培养10-15d。
等待愈伤长大后继代,从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤组织用于农杆菌转化。
3、农杆菌介导转化农杆菌介导的水稻转化整个操作过程包括:愈伤组织的预培养、农杆菌的处理、转化和洗菌。
(1)愈伤组织的预培养选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤组织,转接到预培养培养基中,置于27℃暗培养3天。
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方法1NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L)KNO3 2830 mg/L(NH4)2SO4 463 mg/LKH2PO4 400 mg/LMgSO4.7H2O 185 mg/LCaCl2.2H2O166 mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8H3BO3 3 mg/L 1.6ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025KI 0.75 mg/L 0.8盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5肌醇myo-inositol 100 mg/L 100水解酪蛋白300 mg/L谷氨酰胺500 mg/L脯氨酸500 mg/L蔗糖30,000 mg/LPHytagel 2.6 mg/LpH 5.8Basic培养基B N6(大量)50ml (20倍)A Ms-Fe盐10-20ml(100倍)CH 0.3g/LS B5 macro 10ml (100倍)phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml (100倍)sucrose 30g/LC proline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.3 CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O4 配好后放于棕色瓶4℃保存MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO31900 mg/L38g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L养NH4NO3 1650 mg/L33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L8.8 g/L基KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L制备1 KNO3, NH4NO3, Mg SO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,3 CaCl2.2H2O同KH2PO44 配好后放于棕色瓶4℃保存Ms(大量花药用)终浓度母液(20倍) 终浓度母液元素KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L培养(NH4)2SO4 231 mg/L 4.62 g/L CaCl2.2H2O 160 mg/L3.2 g/L基KH2PO4641 mg/L12.82 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O3 配好后放于棕色瓶4℃保存YM脓杆菌培养基KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine2g/LNaCl 0.2g/L M g SO40.2g/L Yeast extract0.3g/LAgar 15g/L PH=7.0诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8共培养培养基液体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)+ 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS固体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同) + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%ASPH=5.5 加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS筛选培养基诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml) PH=5.5一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降分化1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)培养2: basic+KT(0.5mg/L)+NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)基PH=5.8分化培养基NB培养基:6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg壮苗培养基(生根)sucrose 30g/L N6 25ml/L MS-Fe盐10ml/LB5vita 10ml/L agar 7g/LMS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)终浓度母液(100倍)FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.配好后4℃保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解AS(乙酰丁香酮)用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解,用水稀释定容到10ml,过滤灭菌后分装到EP管中,冰冻保存B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度母液(100倍)肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l0.1g/lpyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L1 g/l棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/LNa2MnO4.2H2O 0.25mg/LCuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L程序1.种子去皮,挑成熟完整健康的种子2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟,洗3-4次,用0.1%升汞浸泡20-40分钟3.无菌水洗3至4次4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上5.摆放到诱导愈伤培养基上,黑暗中培养15-20天,直到长出黄色较大的愈伤6.剥下愈伤,转至继代培养基上,黑暗培养2周7.共培养。
脓杆菌与愈伤在液体共培养基中轻轻摇培30分钟,转至共培养基(用虑纸盖住培养基)上,吹风3-4小时。
黑暗培养3天8.转至筛选培养基上,吹风吹干。
黑暗培养2周。
转至二筛培养基上,黑暗培养2周,直到长出新的愈伤。
9.转至分化培养基上,黑暗培养一周。
然后明暗交替(16小时:8小时)10.剪苗后,转至生根壮苗培养基上11.移苗到温床,田间。
方法2水稻转化(来自文献/content/nt36q44450563406/fulltext.pdf)For rice transformation, mature rice seeds were de-husked and sterilised with 3% sodium hypochlorite (30 min). The seeds were thoroughly washed three times with sterile distilled water and transferred onto MS basal medium (Murashige and Skoog 1962) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolyte, 2 mg/l 2,4-dichlorphenoxy acidic acid (2,4-D) and 30 g sucrose, for 1 week. The freshly induced calli were dipped in Agrobacterium tumefaciens (AGL1 strain) and transferred onto NB medium (N6 macro-elements, B5micro-elements) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolysate, and 30 g sucrose. After co-cultivation with Agrobacterium (no dim light, 28℃, 2 days), the calli were transferred onto NB medium containing 2 mg/l 2,4-D, 120 mg/lG418, and 500 mg/l Cefotaxime. The resistant calli were subcultured on fresh plates at 2-week intervals for 4 weeks, and then transferred onto MS medium containing 0.2 mg/l anaphthalene acetic acid (NAA), 3 mg/l 6-benzylaminopurine (6-BA) and 150 mg/l G418 until shoots regenerated. Shoots were transferred onto 1/2 MS medium containing 0.5 mg/l NAA for rooting and further growth. The transgenic plants were grown in the field or at 28℃under a 16/8 h light/dark cycle in the greenhouse.配置1升诱导培养基:1.水解酪蛋白300 mg/L2.谷氨酰胺500 mg/L3.脯氨酸500 mg/L4.肌醇100 mg/L5.蔗糖30g/L6.PHytagel 2.6 mg/LN6大量50毫升,B5微量5毫升,B5维生素5毫升,铁盐毫升,2,4-D母液2毫升,pH 5.85.1 水稻转化受体的准备5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟,然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液(活性氯含量为1.25%)浸泡90分钟,进行表面灭菌。