淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。

α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。

β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca 2+及Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使其钝化。

通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。

淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基-5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

1 酶活测定方法

（1）标准曲线的制作(见下表)

①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。

表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值

试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520

(2)粗酶液淀粉酶活力测定

①待测粗酶液的制备：

发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步

纯化的淀粉酶。

②按以下顺序操作：

取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1 ml 于各只试管中，于60℃水浴中预热5min 柠檬酸淀粉缓冲液同时在60℃水中预热5min ，→取柠檬酸淀粉缓冲液1ml 加入试管中,于60℃水浴中保温30min →加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至20 ml 。→摇匀,用分光光度计测定OD520 nm 值。在上述条件下以单位体积样品在30 min 释放1 mg 麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。

在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力 酶活力测定公式：

淀粉酶活力=麦芽糖含量（mg ）·淀粉酶原液总体积（mL ）/所加淀粉质量

每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：

表2样品酶活力测定步骤 反应顺序 样品（重复3个）

样品空白

标准空白

样品稀释液（ml ） 1 1 0

蒸馏水 0 0 1

60℃预热5min

依次加入淀粉溶液（ml ）

1.5 1.5

1.5

混合60℃保温30min

依次加入DNS 试剂

（ml ）

1.5

1.5

1.5

混合100℃煮沸5min 加入0.4mol/L NaOH 溶液终止反应

加入蒸馏水至总体积（ml ）

20 20

20

反应后的试样在室温下静置10min ，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm 离心10min ，上清液以标准空白调零，在分光光度计520nm 波长处测定样品空白（A 0）和样品溶液（A ）的吸光值，A －A 0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。

2 活性计算

酶活力单位定义：在60℃、PH5.6条件下，每小时从2％的可溶性淀粉溶液中释放出1mg 尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位（U ）

淀粉酶活性U 按下式计算： U = ×F

其中：U ——样品淀粉酶活性，U/ml ； K ——标准曲线斜率；

K ×（A －A 0） S ×（30÷60）×180

F——样品溶液反应前的总量，ml；

S——样品测试量；表1中S＝1ml；

60——1小时为60min；

30——反应时间，min。

试剂

(1)2% 淀粉溶液

(2) 0.4mol/L 氢氧化钠

(3) pH5.6 柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g ，溶解后定容至1000mL ，为 A 液。称取柠檬酸钠29.41g ，溶解后定容至1000mL ，为B 液。取A 液13.7mL 与

B 液26.3mL 混匀，即为pH5.6 之缓冲液。

(4) 3,5- 二硝基水杨酸精确称取1g3,5- 二硝基水杨酸溶于20mL 1mol/L 氢氧化钠中，加入50mL 蒸馏水，再加入30g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml ，盖紧瓶塞，防止CO 2进入。