新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离_施雨露

中国组织工程研究 第17卷 第24期 2013–06–11出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research June 11, 2013 Vol.17, No.24

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.007 []

施雨露，李晓辕，曹美娜，于姝媛，王苹. 新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离[J].中国组织工程研究，2013，17(24): 4414-4420.

P .O. Box 1200, Shenyang 110004

4414

www.CRTER

.org

施雨露，1963年生，江苏省启东市人，汉族，1990年白求恩医科大学大学毕业，主管技师，主要从事免疫和遗传学方面的研究。

shiyl@

通讯作者：王苹，博士，副教授，吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林省长春市 130021 wang_ping@

中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2013)24-04414-07

收稿日期：2012-10-21 修回日期：2012-12-01 (20120821002/D ·Y)

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

施雨露1，李晓辕2，曹美娜3，于姝媛3，王 苹3

1吉林大学白求恩医学院病原免疫细胞遗传实验中心，吉林省长春市 130021 2吉林大学第一医院呼吸科，吉林省长春市 130021

3吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林省长春市 130021

文章亮点：

心肌细胞原代培养普遍存在心肌细胞纯度不够、细胞生长状态不稳定和细胞老化等问题。实验采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶消化，提高了心肌细胞从组织中的释放度和细胞活性，2次差速贴壁，尽可能分离心肌成纤维细胞和心肌细胞；最后采用马血清替代牛血清的培养基培养心肌细胞，结果获得的心肌细胞量大，活性好且纯度高。其中胰蛋白酶低浓度冷消化和马血清替代培养基中的牛血清为本文首创。 关键词：

组织构建；心脏组织构建；心肌细胞；心肌成纤维细胞；胰蛋白酶；胶原酶；复合消化；细胞培养；马血清；牛血清；增殖；分化

摘要

背景：利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异，通过优化心肌细胞的培养条件，一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。

目的：探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。

方法：采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化，差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件，免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。

结果与结论：心肌培养48 h 时Troponin T 阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P < 0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法，心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好，且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。

Simultaneous isolation of myocardial cells and cardiac fibroblasts from neonatal rats

Shi Yu-lu 1, Li Xiao-yuan 2, Cao Mei-na 3, Yu Shu-yuan 3, Wang Ping 3

1 Experimental Center of Pathogenobiology-Immunology-Cell Biology and Genetics, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

2 Department of Respiratory Medicine, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

3 Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

Abstract

BACKGROUND: Myocardial cells and cardiac fibroblasts are simultaneously isolated through optimizing the culture conditions of myocardial cells, by use of the variations of adhesion properties of myocardial cells.

OBJECTIVE: To explore the co-separation method for myocardial cells and cardiac fibroblasts in newborn rats.

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

4415

Shi Yu-lu, T echnician-in-charge, Experimental Center of Pathogenobiology-Immunology-Cell Biology and Genetics, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China shiyl@

Corresponding author: Wang Ping, M.D., Associate professor, Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China wang_ping@

Received: 2012-10-21 Accepted: 2012-12-01

METHODS: Myocardial tissue in newborn rats was digested with low concentration trypsin at cold conditions and with collagenase II at 37 . The myocardial cells and cardiac fibroblasts were isolated with differential

℃centrifugation method, and myocardial cell culture conditions were improved using different kinds of serum. Immunofluorescence staining was used to evaluate the purity of myocardial cells and cardiac fibroblasts. RESULTS AND CONCLUSION: The myocardial Troponin T positive cell rate was 89.3% at culture 48 hours, and myocardial fibroblast vimentin positive cell rate was 93.6% at passage 2. The percentage of positive myocardial cells cultured with medium containing horse serum was obviously higher than that with bovine serum culture (P < 0.05). This isolation method of rat myocardial cells can gain myocardial cells and cardiac fibroblasts at the same time, with high purity and good activity.

Key Words: tissue construction; heart tissue construction; myocardial cells; cardiac fibroblasts; trypsin; collagenase; combined digestion; cell culture; horse serum; bovine serum; proliferation; differentiation

Shi YL, Li XY, Cao MN, Yu SY, Wang P. Simultaneous isolation of myocardial cells and cardiac fibroblasts from neonatal rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(24): 4414-4420.

0 引言

心肌细胞体外培养能提供单一细胞的同源性集落，并且不受神经、体液因素影响，已成为研究心肌信号传导和药物筛选的基本方法之一。体外培养的心肌细胞中通常存在两大类：心肌细胞(myocardial cells)和心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CF)，还有少量的血管内皮细胞等。此外因其特殊的组织结构，心肌细胞在分离时极易受伤，心肌成纤维在几代后也出现老化。因此，如何快速分离得到纯化的心肌细胞和心肌成纤维细胞是实验成功的关键。自Haracy 等[1]首次分离乳鼠的心肌细胞进行培养以来，国内、外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究和改良，旨在提高心肌细胞的产量和活力。

心肌细胞的培养方法已有很多报道，但均存在细胞存活率低、纯度不高等问题。常见的心肌细胞分离有2种，组织块分离和酶消化法，其中组织块分离法目前很少应用，多采用酶消化法[2-3]。常用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶以及Dispase 和透明质酸酶[4-8]。胰蛋白酶作用较强，可分解心肌组织间酪蛋白成分，有效解离心肌细胞，但对心肌细胞膜蛋白亦有较强的破坏作用，容易损伤心肌细胞。而胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤较小，目前被广泛采用。由于源于心肌组织的原代培养为混合细胞培养，如何分离相对纯净的心肌细胞，在实验周期中抑制非心肌细胞生长，是保证实验成功的关键步骤。汪长华和陈克研等[9-11]在心肌培养液中加入10 μmol/L 的阿胞糖苷，抑制有丝分裂速度快的非心肌细胞DNA 合成，但阿胞糖苷对细胞有一定毒性。此外在心肌细胞分离时，利用心肌细胞贴壁较心肌成纤维细胞慢的特性，首次接种细胞采用差速贴壁的方法，分别培养也得到相对纯净的心肌细胞和心肌成纤维细胞[12-14]。

实验介绍一种采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化，通过改良心肌细胞培养条件，差速贴壁分离心肌和心肌成纤维细胞的原代培养方法，为研究心脏疾病提供理想的体外实验体系。

1 材料和方法

设计：动物实验，对比观察。

时间及地点：于2010年1月至2010年6月在吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科实验室完成。