黄连内源性植物激素

植物内源性激素对三角叶黄连与峨眉黄连花的发育的影响

摘要：

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材样品。2009年3月在峨眉山市黄湾乡采集三角叶黄连不同时期的新鲜的花，低温冷冻保存。

1.1.2 药剂与仪器。药剂：赤霉素对照品（Sigma）；吲哚乙酸对照品（Sigma）；脱落酸对照品（Aidrich）；甲醇（分析纯、色谱纯）；乙酸乙酯（分析纯）、石油醚（分析纯）、乙腈（色谱纯）；水为超纯水。仪器：高效液相色谱仪（LC-20T泵，SPD-20A紫外检测器，N2000 SP1色谱工作站）；电子天平（型号：BS224S ，d = 0. 000 1 g ，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersi ODS 18（4.0×200mm，5μm）；流动相：甲醇：0.6%乙酸：乙腈（30：65：5）；检测波长：254nm；流速：0.800ml/min；柱温：28℃。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取赤霉素对照品65.5mg、吲哚乙酸对照品9.6mg、脱落酸6.5mg，分别用甲醇定容在10ml的容量瓶中，再依次从上述三个容量瓶中量取8.8m l、1ml、0.2定容到10ml容量瓶，即得到赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸的混合对照品溶液（每1ml含赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸分别为1.76mg、0.96mg、0.13mg）。

1.2.3 供试品溶液的制备

准确称取0.500g三角叶黄连花蕾期、盛花期和末花期的花3份，80%的冰冻甲醇1:10（W:V）加入抗氧剂、PVPP 低温共同研磨，4℃低温避光浸提12h，4℃5000r/min离心10min，残渣再用80%的冰冻甲醇1:5（W:V）浸提2次，每次3h，离心10min，残渣用少许80%甲醇洗3次, 合并滤液和洗液，30℃减压浓缩至原体积的1/3，石油醚2:1萃取3次，弃去上层石油醚相，水相用0.1MNaOH调pH8.0，抽滤3次，水相用HAc调pH3.0，乙酸乙酯2:1萃取3次，合并乙酸乙酯相。减压浓缩至干，用流动相吸出定容，用于HPLC分析。

1.2.4 线性关系考察

精密吸取赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸的混合对照品溶液1μl、3μl、6μl、9μl、12μl、15μl 依次进样，测定其峰面积。

1.2.5 精密度试验

精密吸取赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸的混合对照品溶液10μl，重复进样6次，测定其峰面积。

1.2.6 稳定性试验

取同一样品溶液10μl，于0、2、4、6、8、10h进样，测定其峰面积。

1.2.7 重现性试验

取同一批样品，按供试品溶液制备方法平行制备供试品溶液6份，按前述高效液相色谱法重复测定。

1.2.8 加样回收率试验

精密吸取已知含量的样品6份，每份约0.5g，分别加入对照品溶液，按样品测定方法测定，按公式（回收率=（测出总量-对照品含量）/对照品加入量×100%）计算回收率。

1.2.9样品测定

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各6μl ，分别注入液相色谱仪中，依上述色谱条件测定峰面积，按外标法计算含量。

2结果与分析

2.1线性关系考察结果

赤霉素峰面积测定结果依次为: 69039、214025、467191、711071、954317、1219162；吲哚乙酸峰面积测定结果依次为: 18869、58820、127977、191198、265679、334855；脱落酸峰面积测定结果依次为: 49619、140527、276261、417453、560993、717816。以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得赤霉素的标准曲线方程为Y= 46 722X – 24 629，R² = 0.999；吲哚乙酸的标准曲线方程为Y = 23 606X – 7 509，R²= 0.999；脱落酸的标准曲线方程为Y = 36518X - 3518，R² = 0.999。

2.2精密度实验结果

赤霉素峰面积测定结果依次为: 512145、501851、524466、517700、505129、524170，平均值为514243.5，RSD为1.86%；吲哚乙酸峰面积测定结果依次为: 140395、139970、143480、141876、137500、142611，平均值为140972，RSD为1.53%；脱落酸峰面积测定结果依次为: 304987、297328、303758、306103、299785、310534，平均值为303749.17，RSD为1.54%。

2.3稳定性实验结果

赤霉素峰面积测定结果依次为: 286039、285583、294790、279415、280713、288014，平均值为285759，RSD为1.93%；吲哚乙酸峰面积测定结果依次为: 14116、13856、14089、14398、14491、14059，平均值为14168.17，RSD为1.66%；脱落酸峰面积测定结果依次为: 278269、279524、272243、274347、275420、270477，平均值为275046.7，RSD为1.26%。

2.4重现性实验结果（雅连盛花期）

赤霉素峰面积测定结果依次为: 741733、720711、732803、731019、725344、711693，平均值为727217.2，RSD为1.43%；吲哚乙酸峰面积测定结果依次为: 171764、180087、172532、172804、170865、173173，平均值为173537.5，RSD为1.91%；脱落酸峰面积测定结果依次为: 460770、469928、458576、473927、450894、463297，平均值为462898.7，RSD为1.78%。

2.5加样回收率实验结果（雅连盛花期）

表3-1 赤霉素加样回收率试验结果

序号 1 2 3 4 5 6

赤霉素量（mg）0.261 0.258 0.263 0.265 0.259 0.264

加入赤霉素量（mg）0.26 0.26 0.26 0.26 0.26 0.26

测得赤霉素量（mg）0.518 0.517 0.515 0.518 0.525 0.518

回收率（%）0.998 0.996 0.969 0.973 1.02 0.977

平均值（％）0.988

RSD（%）

2.6样品含量测定结果

赤霉素吲哚乙酸脱落酸

味连初花期0.003590655 0.000597345 1.86903E-06

味连盛花期0.027798810 0.002232504 2.00784E-05

味连末花期0.007985436 0.002033462 2.00029E-05

味连初果期0.018352096 0.000268649 7.72425E-06

雅连初花期0.013732688 0.000547126 3.01898E-05