发酵工程第四章发酵工业的无菌技术

（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 ➢染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
➢措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况 。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗 生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌 罐，抑制杂菌。
4）发酵后期染菌
➢发酵后期发酵液内已积累大量的产物， 特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀 灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响 不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可 以提前放罐。
➢措施 如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可 以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。
3）发酵中期染菌
➢ 发酵中期染菌，处理困难，危害很大。
➢发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘 ，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已 产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量 泡沫。
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不
太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基
丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重 抑制菌生长和合成代谢产物。
B. 霉菌 PenG：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，
而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。 不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉 素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。 青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无 所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。
2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后 发酵液某些理化性质的改变，使产物的提取 变得困难，造成得率降低或使产品质量下降；
3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH ，从而使生物化学反应发生异常变化；
5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生 产失败等。
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶， 发酵液粘度增加，过滤困难 预处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝 剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶 媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生 乳化
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面 ，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的 交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时 与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌
D. 疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深 层培养，这是一类不加提纯而直接使用的 产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂 菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全 部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂 菌后的损失也越大。
污染其它杂菌 ➢有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫， 即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵 过程的通气搅拌。 ➢有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH 下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢 杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次 染菌后会反复染菌。
控制有害微生物主要有以下几种措施：
杀灭一切微生物
杀灭病原微生物
比较项目 处理因素
处理对象
灭菌
消毒
防腐
化疗
强、理化因 素
任何物体内 外
理、化因素
生物体表， 酒、乳等
理、化因素
有机物体内 外
化学治疗剂 宿主体内
微生物类型 一切微生物 有关病原菌 一切微生物 有关病原菌
对微生物作 彻底杀灭 用
杀死或抑制 抑制或杀死 抑制或杀死
实例
加压蒸气灭 70%酒精消 冷藏、干燥、抗生素、磺
菌，辐射灭 毒、巴氏消 糖渍、盐腌、胺药、生物
菌、化学杀 毒法
缺氧、化学 药物素
菌剂
防腐剂
什么是染菌？
➢ 发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌 生长繁殖。
4.2.1 杂菌污染的危害
1）由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗 而损失，造成产率的下降；
➢链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰 生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 ➢灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
灭菌(steቤተ መጻሕፍቲ ባይዱilization):用化学或物理方法杀死 物料或设备中所有有生命物质的过程。
消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死 空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或 液体中的微生物及其孢子。
防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或 抑制微生物的生长和繁殖 。
（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响
1）种子培养期染菌 ➢ 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势
，而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子 染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌， 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
2）发酵前期染菌
➢发酵前期最易染菌。
➢原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势 ；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌 能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。