乳糖微生物限度验证方案

目录

1.目的3

2.范围3

3.职责3

4.参考文件3

5.系统概述4

6.验证用仪器、菌种和培养基4

6.1验证用仪器4

6.2验证用菌种4

6.3验证用培养基4

7.验证实施4

7.1验证文件确认5

7.2需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查6

7.3需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证6

7.4控制菌检查用培养基的适用性检查6

7.5控制菌检查方法验证8

8.偏差清单及报告9

9.验证周期9

10.验证结果分析与评价报告9

11.验证附表10

表1验证方案培训记录表11

表2文件的确认12 表3菌液计数结果13 表4需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录14

表5需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录15

表6控制菌检查用培养基的适用性检查记录16

表7控制菌检查方法验证17

表8偏差清单18

表9偏差报告19

表10验证结果分析与评价报告20

1.目的

依据《中国药典》（2015年版四部）,对乳糖新建立的微生物限度检查方法进行验证，以确认在目前的检验环境下该方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌测定及控制菌的检查。

2.范围

本验证方案适用于乳糖的微生物限度检查法的验证。

3.职责

3.1验证小组成员及职责

3.2验证方案培训：

本验证方案批准后，根据《人员培训标准操作规程》对确认小组成员和相关人员进行培训，

使其了解方案的实施程序，明白其职责并能在验证工作中得到很好的执行。见表1. 4.参考文件

本验证方案参考了以下标准和指南：

《药品生产质量管理规范》（2010年版） 《药品微生物学检验技术》 《药品生产验证指南》（2003年版） 《中国药典》（2015年版四部） 5.系统概述

参照《中国药典》（2015年版二部及四部）采用的检测方法对葡萄糖原料新建立的微生物限度检查法进行验证，以确认所采用的方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌的测定和控制菌的检查。可以照此检查法和此检查条件进行供试品的微生物限度检查。

6.验证用仪器、菌种和培养基

7.验证实施

7.1验证文件确认

目的

验证支持文件的确认，用来保证验证的一致性、有效性。

程序

检查《乳糖糖质量标准》、《微生物限度检查法操作规程》、《培养基适用性检查操作程序》及相关记录是否齐全、是否是现行批准的文件。

可接收标准

与本次验证相关的文件及记录齐全，均为现行版本。

确认结果

结果见“表1 文件确认”。

7.2需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查

目的

确认使用的需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基适用性检查符合要求。

程序

菌液制备

取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时，将培养物1，加入到90.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1含菌数不大于100 的菌悬液，备用。

取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25℃培养2～3天，将培养物1，加入到90.9%无菌氯化钠注射液中，10倍稀释制成每1含菌数不大于100 的菌悬液，备用。

取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，经20～25℃培养5～7天，加入3～5含0.05%（）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取此菌原液1，用含0.05%（）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9，10倍稀释制成每1含孢子数不大于100 的孢子悬液，备用。

菌液计数（取2个平皿的平均值）：取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌1分别接种至2个无菌培养皿中，每皿注入胰酪大豆胨琼脂培养基约20，倒置于生化培养箱30～35℃培养3天，计数；取白色念珠菌、黑曲霉菌液1分别接种至2个无菌培养皿中，每皿注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约20，倒置于霉菌培养箱20～25℃培养5天，计数并取其平均值。

②计数培养基适用性检查

胰酪大豆胨琼脂培养基取7个无菌平皿，分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2平皿，每皿接种1（含菌不大于100），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后置于30～35℃培养3天，计数。取4个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2个无菌平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂对照培养基，混匀，凝固后置于30～35℃培养5天，计数；对照培养基同法操作。

沙氏葡萄糖琼脂培养基取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2个平皿，每皿接种1（含菌不大于100），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固后置于20～25℃培养5天，计数；对照培养基同法操作。

可接受标准

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。

确认报告

结果见“表2 菌液计数结果”、”表3 培养基的适应性检查”。

7.3需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法的验证

目的

确认所采用的计数方法适合于产品的需养菌总数、霉菌及酵母菌的测定。

程序

菌液制备：

取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时将培养物1，加入到90.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1含菌数不大于100 的菌悬液，备用。

取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25℃培养2～3天，将培养物1，加入到90.9%无菌氯化钠注射液中，10倍稀释制成每1含菌数不大于100 的菌悬液，备用。

取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5含0.05%（）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取此菌原液1，用含0.05%（）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9，稀释制成每1含孢子数不大于100 的孢子悬液，备用。

②验证步骤：

取供试品1个批号，每批中验证试验包括3组进行独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的比值。

a.试验组：取1：10的供试液10加入适量的试验菌液，混匀，使每1供试液中含菌量不大于100，再取1注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

b.菌液组：取稀释液10，同试验组操作，测定其菌数。

c.供试品对照组：取1：10的供试液1，测定供试品菌数。

可接受标准

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。稀释剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数

试验组菌数比值=

菌液对照组平均菌落数

确认报告

结果见”表4 需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录”。

7.4控制菌检查用培养基的适用性检查

目的

确认使用的控制菌计数培养基适用性检查符合要求。

程序

①菌液制

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时，将培养物1，加入到90.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1含菌数不大于100 ，备用。