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最后加入底物，从而达 到用酶标记抗原抗体反应的 效果
常用的标记酶： 1. 辣根过氧化物酶
2.碱性磷酸酶
１.辣根过氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP）
常用的两种方法是： （1）过氧化物酶标记抗体法 （2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法
（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）
免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：
抗 血 清 — 多克隆抗体，是用提纯的抗原 免疫动物后从动物血清制备得 到的
单克隆抗体 — 是指由单个产生特异抗体的 Ｂ淋巴细胞分化增殖形成的 细胞克隆产生的抗体
五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可的物质
1 免疫荧光技术 2 免疫酶技术 3 免疫亲和技术 4 胶体金技术
第六章
免疫细胞化学技术（免疫组化）
( immunocytochemistry ) 是利用免疫反应来定位组织和
细胞中特异大分子的一类技术
免疫细胞化学技术 第一节 免疫细胞化学原理 ★ 第二节 免疫细胞化学方法
第一节 免疫细胞化学原理
一、免疫反应的特异性 二、免疫细胞化学反应 三、抗原 四、抗体 五、标记物及其在光镜和电镜下可见性
（Alkaline phosphotase－Antialkaline phosphotase）
APAAP法的原理： 以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞 化学反应使抗原抗体反应可见 常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等
（三） 亲和细胞化学技术
利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子 亲和物质 具有多价能力的物质，与亲和物质有高
这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗? 从生物学功能来看都包括了哪些物质?
具有抗原性的物质包括：
酶、 受体、 抗体、 细胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体等
四、抗体
Fab
Fc
N N
C
C C
C
N N
抗体的结构
Fab片段 具有抗体活性，决定某种抗体 与抗原结合的能力和特异性
Fc片段
决定该抗体本身作为抗原刺激 机体产生抗体的能力和特异性 决定其本身抗原性
免疫酶技术优点：
1.反应产物定位准确，颜色对比清晰 2.反应后标本材料可长期保存 3.能用于电镜观察
酶
抗原
一抗
二抗
酶标二抗
抗酶抗体
酶—抗酶抗体复合物
酶标记的三种形式
酶标抗体法
抗酶抗体法
复合物法
酶标抗体法
用交联剂将酶与 抗体联接成酶标抗体 用于直接法和间接法
抗酶抗体法或称酶桥法
用酶免疫动物获得抗酶抗体，通 过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接 在一抗上,再加入酶及其底物，达 到用酶标记抗原抗体反应的效果
▲ 呈现不同的荧光： 黄绿色荧光 橙色荧光 橙红色荧光等
荧 光：
在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发 光波长更长的可见光并随照射停止而消失
荧光显微镜：
荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围） 使受检标本内的荧光物质发光
（二） 免疫酶技术
是将酶作为标记物使组织细胞中形成 的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶 细胞化学反应产生显微镜下可见的显色 物质，间接显示抗原物质的定位
度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标 记物(荧光素、酶、胶体金等)结合
最常用的亲和物质系统： 1、生物素（biotin）与亲和素（avidin） 两者结合能力为不可逆的 2、葡萄球菌A蛋白与免疫球蛋白IgG
1.生物素系统标记技术的基本方法
(1) 标记亲和素－生物素技术 （Labeled avidin biotin, LAB）
一抗与组织抗原特异结合 二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起 然后加入HRP的天然底物H2 O2 和捕捉底物DAB 光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)
常用于标记的酶： 1. 辣根过氧化物酶
2.碱性磷酸酶
２.碱性磷酸酶（Alkaline phosphotase, AKP）
碱性磷酸酶技术常用的两种方法： (1)碱性磷酸酶标记抗体 (2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）
（一） 免疫荧光技术
免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合 物在荧光显微镜下可见，从而显示 抗原物质的定位
荧光素
能产生荧光并能作为染料的一类化合物
１.异硫氰酸荧光素
２.四乙基罗达明
３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白
▲ 分子量不同
▲ 最大吸收光谱不同
▲ 最大发射光谱不同 ▲ 与蛋白结合方式不同
一、免疫反应的特异性
免疫反应的特异性表现在：
抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体
产生对其特异的抗体并与抗体发生反应
抗体针对某种抗原分子而产生的，特异地识
别该抗原并与其结合
二、免疫细胞化学反应
免疫细胞化学反应的原理：
把组织细胞中的特异分 子作为抗原,用在显微镜下可 见的标记物标记特异抗体(或 者标记抗原抗体复合物)使特 异的免疫化学反应具有可见 性,从而间接地显示抗原,达 到在细胞或细胞器水平定位 特异分子的目的
由于产生抗酶抗体的动物与产 生第一抗体的动物是同一种属，两 种抗体具有相同的免疫源性，所以 在反应中本来针对一抗的二抗也能 与抗酶抗体结合
பைடு நூலகம்
酶－抗酶抗体复合物法
优点: 1、抗体活性高 2、灵敏度高
先获得抗酶抗体并将抗 酶抗体与酶一起预先制成酶 －抗酶抗体复合物
在反应中，由二抗的桥 梁作用把复合物与一抗连接 在一起
组织抗原 抗体
标记物
1 荧光 2酶 3 亲和技术 4 金标
标记抗体
免疫细胞化学反应过程为：
抗原
标记物
＋
两种免疫反应方法
直接法
间接法
三、抗原
抗 原： 凡能刺激机体产生抗体并能与 抗体特异结合的物质称为抗原
抗原性：
物质所具有的这种特性称为抗原性
细胞中具有抗原性的化学成分有：
蛋白质 多肽 脂蛋白 多糖 脂多糖 糖蛋白 核蛋白
(2) 桥式亲和素－生物素技术 （Bridged avidin biotin,BAB）
(3) 亲和素－生物素-酶复合物技术 （Avidin-biotin peroxidase complex
method，ABC）
生物素
亲和素
生物素化酶 生物素化抗体
亲和素—生物素 —酶复合物
标记亲和素生物素法
生物素与抗体共价偶联 后加入与过氧化物酶（或 荧光素）结合的亲和素
常用的标记酶： 1. 辣根过氧化物酶
2.碱性磷酸酶
１.辣根过氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP）
常用的两种方法是： （1）过氧化物酶标记抗体法 （2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法
（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）
免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：
抗 血 清 — 多克隆抗体，是用提纯的抗原 免疫动物后从动物血清制备得 到的
单克隆抗体 — 是指由单个产生特异抗体的 Ｂ淋巴细胞分化增殖形成的 细胞克隆产生的抗体
五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可的物质
1 免疫荧光技术 2 免疫酶技术 3 免疫亲和技术 4 胶体金技术
第六章
免疫细胞化学技术（免疫组化）
( immunocytochemistry ) 是利用免疫反应来定位组织和
细胞中特异大分子的一类技术
免疫细胞化学技术 第一节 免疫细胞化学原理 ★ 第二节 免疫细胞化学方法
第一节 免疫细胞化学原理
一、免疫反应的特异性 二、免疫细胞化学反应 三、抗原 四、抗体 五、标记物及其在光镜和电镜下可见性
（Alkaline phosphotase－Antialkaline phosphotase）
APAAP法的原理： 以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞 化学反应使抗原抗体反应可见 常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等
（三） 亲和细胞化学技术
利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子 亲和物质 具有多价能力的物质，与亲和物质有高
这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗? 从生物学功能来看都包括了哪些物质?
具有抗原性的物质包括：
酶、 受体、 抗体、 细胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体等
四、抗体
Fab
Fc
N N
C
C C
C
N N
抗体的结构
Fab片段 具有抗体活性，决定某种抗体 与抗原结合的能力和特异性
Fc片段
决定该抗体本身作为抗原刺激 机体产生抗体的能力和特异性 决定其本身抗原性
免疫酶技术优点：
1.反应产物定位准确，颜色对比清晰 2.反应后标本材料可长期保存 3.能用于电镜观察
酶
抗原
一抗
二抗
酶标二抗
抗酶抗体
酶—抗酶抗体复合物
酶标记的三种形式
酶标抗体法
抗酶抗体法
复合物法
酶标抗体法
用交联剂将酶与 抗体联接成酶标抗体 用于直接法和间接法
抗酶抗体法或称酶桥法
用酶免疫动物获得抗酶抗体，通 过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接 在一抗上,再加入酶及其底物，达 到用酶标记抗原抗体反应的效果
▲ 呈现不同的荧光： 黄绿色荧光 橙色荧光 橙红色荧光等
荧 光：
在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发 光波长更长的可见光并随照射停止而消失
荧光显微镜：
荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围） 使受检标本内的荧光物质发光
（二） 免疫酶技术
是将酶作为标记物使组织细胞中形成 的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶 细胞化学反应产生显微镜下可见的显色 物质，间接显示抗原物质的定位
度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标 记物(荧光素、酶、胶体金等)结合
最常用的亲和物质系统： 1、生物素（biotin）与亲和素（avidin） 两者结合能力为不可逆的 2、葡萄球菌A蛋白与免疫球蛋白IgG
1.生物素系统标记技术的基本方法
(1) 标记亲和素－生物素技术 （Labeled avidin biotin, LAB）
一抗与组织抗原特异结合 二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起 然后加入HRP的天然底物H2 O2 和捕捉底物DAB 光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)
常用于标记的酶： 1. 辣根过氧化物酶
2.碱性磷酸酶
２.碱性磷酸酶（Alkaline phosphotase, AKP）
碱性磷酸酶技术常用的两种方法： (1)碱性磷酸酶标记抗体 (2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）
（一） 免疫荧光技术
免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合 物在荧光显微镜下可见，从而显示 抗原物质的定位
荧光素
能产生荧光并能作为染料的一类化合物
１.异硫氰酸荧光素
２.四乙基罗达明
３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白
▲ 分子量不同
▲ 最大吸收光谱不同
▲ 最大发射光谱不同 ▲ 与蛋白结合方式不同
一、免疫反应的特异性
免疫反应的特异性表现在：
抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体
产生对其特异的抗体并与抗体发生反应
抗体针对某种抗原分子而产生的，特异地识
别该抗原并与其结合
二、免疫细胞化学反应
免疫细胞化学反应的原理：
把组织细胞中的特异分 子作为抗原,用在显微镜下可 见的标记物标记特异抗体(或 者标记抗原抗体复合物)使特 异的免疫化学反应具有可见 性,从而间接地显示抗原,达 到在细胞或细胞器水平定位 特异分子的目的
由于产生抗酶抗体的动物与产 生第一抗体的动物是同一种属，两 种抗体具有相同的免疫源性，所以 在反应中本来针对一抗的二抗也能 与抗酶抗体结合
பைடு நூலகம்
酶－抗酶抗体复合物法
优点: 1、抗体活性高 2、灵敏度高
先获得抗酶抗体并将抗 酶抗体与酶一起预先制成酶 －抗酶抗体复合物
在反应中，由二抗的桥 梁作用把复合物与一抗连接 在一起
组织抗原 抗体
标记物
1 荧光 2酶 3 亲和技术 4 金标
标记抗体
免疫细胞化学反应过程为：
抗原
标记物
＋
两种免疫反应方法
直接法
间接法
三、抗原
抗 原： 凡能刺激机体产生抗体并能与 抗体特异结合的物质称为抗原
抗原性：
物质所具有的这种特性称为抗原性
细胞中具有抗原性的化学成分有：
蛋白质 多肽 脂蛋白 多糖 脂多糖 糖蛋白 核蛋白
(2) 桥式亲和素－生物素技术 （Bridged avidin biotin,BAB）
(3) 亲和素－生物素-酶复合物技术 （Avidin-biotin peroxidase complex
method，ABC）
生物素
亲和素
生物素化酶 生物素化抗体
亲和素—生物素 —酶复合物
标记亲和素生物素法
生物素与抗体共价偶联 后加入与过氧化物酶（或 荧光素）结合的亲和素